一种固定化酰化酶稳定剂及提高固定化酰化酶储存稳定性的方法与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种固定化酰化酶稳定剂及提高固定化酰化酶储存稳定性的方法。

背景技术：

青霉素酰化酶，又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β-内酰胺类抗生素。对青霉素酰化酶高效固定化以提高其对温度、ph值、溶剂极性等方面的适用性和反复回用的稳定性，是拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。

7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanicacid，7-aca）是合成头孢类抗生素最重要的中间体，一般有头孢菌素c通过化学法或者生物酶法脱去侧链分子制得。但由于化学法具有工艺复杂、反应条件苛刻、高污染等缺点，现已被操作简便、节能、环保的生物酶法所取代。生物酶法目前又可分为两步酶法和一步酶法，本发明中所述的固定化头孢菌素酰化酶即为一步酶法中所用到的酶。

众所周知，液体酶在工业生产及应用过程中存在着易受环境影响而失活，使用后难以回收再利用等很大的弊端，所以目前实际应用中一般都将酶进行固定化，以方便其运输、使用及储存。

然而，在固定化酶的储存过程中还是发现每经过一段时间酶的活性就会有一定的损失。而将固定化酶浸泡在含有保护剂的溶液中是一种提高其储存稳定性的有效方法，且该方法具有操作简单及成本低廉等优点。常用的保护剂有防腐剂、糖类、醇类、还原剂及盐类等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能提高固定化酰化酶储存稳定性及提高固定化酰化酶储存稳定性的方法，使浸泡在保护液中的固定化酶在储存了较长一段时间后仍能保持较好的酶活力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种固定化酰化酶稳定剂，该稳定剂含有防腐杀菌剂0.1wt%～0.5wt%，以及醇类1wt%～5wt%、糖类1wt%～5wt%、还原剂0.5～2mmol/l、盐类0.01～0.05mol/l中的一种或几种。

优选地，所述稳定剂以0.01-0.03mol/l的tris-hcl为基础溶液，所述防腐杀菌剂为对羟基苯甲酸甲酯，糖类为果糖，醇类为甘油或肌醇，还原剂为二硫苏糖醇，盐类为mgso4或磷酸盐。

优选地，所述基础溶液的ph为7.0-9.0。

优选地，包括如下组分：0.01-0.03mol/ltris-hcl的基础溶液（ph8.0）和0.2wt%对羟基苯甲酸甲酯。

优选地，包括如下组分：ph8.0，0.02mol/ltris-hcl的基础溶液、2mmol/l的二硫苏糖醇和0.2wt%对羟基苯甲酸甲酯。

一种提高固定化酰化酶储存稳定性的方法，其特征在于，以固定化酰化酶为基础，将其浸泡在上述稳定剂的溶液中，在4-25℃保存。优选地，保存温度为4℃。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的保护液对酶活保护作用最好，而且其添加量很小对储存成本影响不大，有助于开发廉价易得的固定化酶保护液。

添加有二硫苏糖醇（dtt）的固定化头酰化酶保护液，能有效的抑制微生物的生长和繁殖，对固定化酰化酶的保护效果较好，25℃下储存9周及4℃下储存12个月，可使酶活保留率有很大提高。所用dtt是二硫键的还原剂，可以保持酶中-sh的还原态，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键，此外还对酶活力也有显著的激活作用，因此会对固定化酰化酶酶活有较好的保护作用。

附图说明

图1为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯（实施例1）对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图2为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和肌醇（实施例2）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图3为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和mgso4（实施例3）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图4为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和果糖（实施例4）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图5为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和甘油（实施例5）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图6为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和dtt（实施例6）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图7为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和磷酸盐（实施例7）在25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图8为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和dtt（实施例8）分别在4℃及25℃下对固定化头孢菌素酰化酶的保护作用。

图9为防腐杀菌剂对羟基苯甲酸甲酯和dtt（实施例9）分别在4℃及25℃下对固定化青霉素酰化酶的保护作用。

图1-7中，1为对照，2为实施例，图8-9中，1为25℃保存，2为4℃保存。

具体实施方式

1实验试剂：

树脂，西安蓝晓科技公司；对羟基苯甲酸甲酯、果糖、甘油、肌醇、二硫苏糖醇（dtt），上海生工；mgso4及磷酸盐，天津试剂公司。

2实验设备

高压均质机，ats；ph计，mettler；摇床，上海新苗；循环水真空泵，河南巩义；电子天平，上海天平仪器厂。

3试验方法

分别配置0.01-0.03mol/ltris-hcl溶液作为基础溶液，向其中分别加入2‰对羟基苯甲酸甲酯、2%肌醇、0.5mmmgso4、2%果糖、5%甘油、1mmdtt、0.02mol/lpbs中的一种或几种。将固定化头孢菌素酰化酶（青霉素酰化酶）浸泡在配置的各种保护液中，以不加任何保护液的固定化酶作为对照，考察一定温度下，经过一定时间后，固定化酶酶活保留率。

4酶活测定

（1）头孢菌素酰化酶酶活测定

酶活定义：一个酶活力国际单位是指规定条件下，每分钟水解1微摩尔的头孢菌素酸所需头孢菌素c酰化酶的量。

称取2.0gcpc钠盐，溶于100ml0.02mol/l，ph8.0的磷酸钾缓冲液中，用0.1mol/l的naoh溶液调节ph至8.0，控温在25℃。取一定量固定化酶加入该溶液中，用0.1mol/l的naoh溶液滴定，控制反应ph为8.0，反应10min，记录消耗的naoh溶液得体积vnaoh。

。

（2）青霉素酰化酶活性测定

精确称取样品500mg，加入预热到28℃的100ml4%的青霉素钾溶液，开启搅拌，控制反应温度28℃，反应中用0.1mol/lnaoh溶液调ph至8.0，控制反应ph8.0，记录约6分钟左右naoh的消耗体积（ml）。

水解活力（28℃）计算

。

v：滴定中消耗的naoh体积（ml）

c：naoh溶液的摩尔浓度（mol/l）

w：样品的重量（g）

t：滴定时间（min）。

对比例1

将发酵并经纯化获得的酶液进行固定化，得到固定化头孢菌素酰化酶，其酶活为100～200u/g。将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为80%、44%、35%、21%。

实施例1

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.01mol/ltris-hcl（ph9.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为99%、55%、51%、48%。

实施例2

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含2%肌醇、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为72%、57%、52%、50%。

实施例3

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含0.5mmmgso4、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.03mol/ltris-hcl（ph7.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为74%、55%、47%、43%。

实施例4

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含2%果糖、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为79%、70%、67%、46%。

实施例5

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含5%甘油、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为91%、70%、69%、63%。

实施例6

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含1mmdtt、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为95%、91%、88%、87%。

实施例7

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含0.02mol/lpbs、2‰对羟基苯甲酸甲酯的溶液（ph8.0）中，将其置于25℃下保存1、3、6、9周，其酶活保留率分别为63%、48%、47%、43%。

实施例8

将固定化头孢菌素酰化酶浸泡在含1mmdtt、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9、12个月，其酶活保留率分别为90%、81%、72%、60%、48%。将其置于4℃下保存1、3、6、9、12个月，其酶活保留率分别为99%、97%、94%、89%、85%。

实施例9

将固定化青霉素酰化酶浸泡在含1mmdtt、2‰对羟基苯甲酸甲酯的0.02mol/ltris-hcl（ph8.0）溶液中，将其置于25℃下保存1、3、6、9、12个月，其酶活保留率分别为98%、89%、82%、75%、66%。将其置于4℃下保存1、3、6、9、12个月，其酶活保留率分别为99%、98%、95%、93%、91%。