环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒的制作方法

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒。

背景技术：

鲤春病毒血症(springviraemiaofcarp，svc)是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，其病原为鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarpvirus，svcv)。该病发病急、死亡率高，死亡率可高达90％，严重危害渔业生产，世界动物卫生组织oie将其列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病，因此成为鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。

svcv病毒粒子长90nm～180nm，宽60nm～90nm，有类脂囊膜，核衣壳中空，螺旋状对称，直径50nm。病毒基因组为单股、负链、不分节段的rna，长约11019个核苷酸，主要包含5个基因:rna聚合酶蛋白(rnapolymerase,l)、糖蛋白(glycoprotein,g)、基质蛋白(matrixprotein,m)、磷蛋白(phosphoprotein,p)和核蛋白(nucleoprotein,n)。该病毒对酸、热及脂溶剂敏感，ph值7～10时稳定，在13℃～22℃均可生长，最适生长温度为17℃。

svcv主要危害越冬以后的幼鲤和一龄以上的鲤鱼，死亡率较高。感染途径是以水体为媒介，通过鳃进入鱼体，再通过粪、尿排出体外。外伤也是一个重要的传播途径。无症状的带毒鱼体能持续数周不断地排出病毒，在低水温时病毒能在被感染的鲤鱼血液中保持11周之久，即呈现持续性的病毒血症时期。鲤鱼急性感染时，在临床上表现为病鱼无目的的漂游，体发黑，腹部肿大；皮肤和鳃渗血；消化道出血，可见腹水严重带血，肠炎、心、肾、鳔有时连同肌肉也有出血症状；内脏水肿，肝部血管有血管炎及水肿，导致血管坏死，肝实质坏死。当病鱼出现这种显性感染时，其肾、脾、腮、脑中会含有大量病毒粒子。

目前，尚缺乏有效控制svcv的药物和方法。国际上通行的控制该病的有效措施是进行svc的监测，及早发现并进行隔离或扑杀。该病的诊断主要依赖于实验室的检测，目前，svcv的检测方法包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养病毒和电镜观察。该类方法操作繁琐，检测周期长，灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定(elisa)和免疫荧光方法。该类方法灵敏度较高，但对抗体要求也高，已有报道表明针对svcv欧洲株制备的抗体不能用于检测亚洲株。另外，该类方法操作也相对繁琐，大量样本检测工作量巨大。因此，建立快速、简便、灵敏的检测方法是水产养殖业的迫切需要。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术是notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号wo00/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条lamp引物，利用一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。

侧向流动试纸条(lateralflowdipstick，lfd)是一种新的检测方法，反应中羟基荧光素fam标记的探针与生物素标记的lamp扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。lfd检测无需特殊的设备，操作者只需取10μl反应产物滴到点样孔内，之后于点样处前端滴加100μl缓冲液，静置3-5分钟，肉眼观察即可。且不需有毒试剂，操作简便且更安全。lamp-lfd结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。lfd试纸条上具有质控带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有质控带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。lamp-lfd结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度，且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒。

本发明提供的一种检测鲤春病毒血症病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；

所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；

所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子。

上述成套引物中，所述上游内引物或所述下游内引物的末端采用生物素标记。

上述成套引物中，所述上游内引物的末端采用生物素标记。

上述成套引物中，所述上游内引物的5'末端采用生物素标记。

上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游内引物和所述下游内引物的摩尔比为1:1:8:8。

本发明第2个目的是提供一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂，由上述的成套引物和探针组成；所述探针为如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子。

所述探针的末端采用羟基荧光素fam标记。

所述探针的5'末端采用羟基荧光素fam标记。

本发明第3个目的是提供一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的试剂。

上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测鲤春病毒血症病毒中的应用也是本发明保护的范围。

上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测鲤春病毒血症病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒中的应用也是本发明保护的范围。

上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第4个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样本的总rna，反转录为cdna；以所述cdna为模板，采用上述的成套引物进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；

2)用上述的试剂中的所述探针杂交所述环介导等温扩增产物，得到杂交产物；

3)采用侧向流动试纸条检测所述杂交产物，若所述试剂条的质控带和检测带均显色，则所述待测样本感染或候选感染鲤春病毒血症病毒，若所述试剂条质控带显色且检测带未显色，则所述待测样本未感染或候选未感染鲤春病毒血症病毒。

所述方法中，所述杂交的条件63℃杂交5min。

所述方法中，所述杂交的反应体系具体为：向步骤1)的扩增产物中加入所述探针(使其在反应体系中的浓度为0.8mmol/l)。

所述方法中，所述步骤3)中的检测方法具体可为：取10μl杂交产物加入到侧向流动试纸条(杭州优思达生物技术有限公司，试剂盒全称：一次性核酸检测试纸条，货号：d003-03)样品垫上，并在点样处前端加入100μlbuffer溶液(试剂盒中自带)中，静置3-5分钟，观察试纸条检测带是否显色。

本发明第5个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样本的总rna，反转录为cdna；以所述cdna为模板，采用上述的成套引物进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；

2)电泳检测所述环介导等温扩增产物，若含有扩增产物，则所述待测样本感染或候选感染鲤春病毒血症病毒，若不含有所述扩增产物，则所述待测样本未感染或候选未感染鲤春病毒血症病毒。

以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的条件为63℃水浴40min。

以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体为：10×缓冲液2.5μl、mgso41.5μl、上游外引物/下游外引物1μl、上游内引物/下游内引物1μl、dntps3.5μl、bstdna聚合酶1μl、模板1μl，无菌水13.5μl，总体积25μl。

缓冲液中各组分及其在所述反应体系中的浓度为：20mmol/ltris-hcl(ph8.8)、50mmol/lkcl、2mmol/lmgso4、10mmol/l(nh4)2so4和0.1％(体积百分含量)的tween-20。

所述反应体系中，mgso4的浓度为6mmol/l，上游内引物和下游内引物的浓度均为1.6μmol/l，上游外引物和下游外引物的浓度均为0.2μmol/l，dntps的浓度为1.4mmol/l，bstdna聚合酶的含量为8u。

本发明所提供的svcv的lamp-lfd检测方法具有如下优点：

一、高灵敏度，对svcv模板dna的最低检测限可至8.6×10^-2ng/μl，即模板含量为86pg(稀释10²倍)。

二、强特异性，所用的特异性引物根据svcv的糖蛋白(g)基因中的六个不同区域设计，并加入特异序列做为dna特异性探针；

三、检测时间短，50分钟左右可获得检测结果，比常规pcr检测时间节省2-4h；

四、仪器设备要求低，不需要pcr仪、电泳仪和凝胶成像系统，只需一个恒温加热器即可完成检测；

五、操作简便、结果明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作，可直接通过肉眼观察即判别，检测结果清晰明显；

六、对实验人员和环境更友好，检测过程不需要进行凝胶电泳，故不使用有毒试剂。

本发明具有比现有传统pcr技术检测svcv的方法具有更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场即时检测，有利于预防控制鲤春病毒血症病毒的爆发，对保护我国水产养殖经济发展具有重要意义。

附图说明

图1为svcv-g基因的lamp-lfd引物和探针设计示意图。

图2为lamp检测svcv的灵敏度。

图3为lamp-lfd检测svcv灵敏度。

图4为lamp检测svcv的特异性。

图5为lamp-lfd检测svcv的特异性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明所采用的技术方案包括以下三个部分：

(1)提供一套用于svcv的lamp引物序列，即长度分别为22bp、18bp、42bp、40bp的寡核苷酸序列，依次命名为svcv-g-f3、svcv-g-b3、svcv-g-fip、svcv-g-bip；

(2)配制lamp反应体系，通过lamp反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；

(3)设计svcv-g-hp为dna探针，结合lfd技术对lamp扩增结果进行分析。

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

鲤春病毒血症病毒(svcv)记载在如下文献中：shivappar,kozlowiczs,rollandj,etal.springviremiaofcarpintheunitedstatesofamerica:evaluationofcurrentdiagnostics[j].diseasesinasianaquaculturevi.fishhealthsection,asianfisheriessociety,manila,philippines,2008:143-156.；公众可以从北京科弘生物技术有限公司获得。

锦鲤疱疹病毒(khv)记载在如下文献中：rahmati‐holasooh,zargara,ahmadivands,etal.firstdetectionofkoiherpesvirusfromkoi,cyprinuscarpiol.experiencingmassmortalitiesiniran:clinical,histopathologicalandmolecularstudy[j].journaloffishdiseases,2016,39(10):1153-1163.；公众可以从北京科弘生物技术有限公司获得。

草鱼呼肠孤病毒(gcrv)记载在如下文献中jabbara,narankhajidm,nolanmj,etal.afirstinsightintothegenotypesofechinococcusgranulosusfromhumansinmongolia[j].molecularandcellularprobes,2011,25(1):49-54.；公众可以从北京科弘生物技术有限公司获得。

实施例1、lamp-lfd技术检测svcv方法建立

一、lamp引物探针设计

对ncbi中公开的svcv的g基因(ab375390)进行同源性分析，并比较了与svcv近似种的g基因的序列，获得了用于检测svcv的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于检测svcv的一套引物探针(上游外引物svcv-g-f3、下游外引物svcv-g-b3、上游内引物svcv-g-fip、下游内引物svcv-g-bip和探针svcv-g-hp)。

序列如下：

svcv-g-f3(序列表的序列1)：5'-gaccccaatatataacccacag-3'；

svcv-g-b3(序列表的序列2)：5'-atcgatccagtgtcctcc-3'；

svcv-g-fip(序列表的序列3)：

5'-cagttcctgatgcaatccttgattcatccaatcagtcctacc-3'；

svcv-g-bip(序列表的序列4)：

5'-tcaaagttgcggatgggcatagaatggggtactaccttgt-3'；

svcv-g-hp(序列表的序列5)：5'-tgaagatctggggtttcccc-3'；

其中，svcv-g-fip的5'端采用生物素标记，svcv-g-hp的5'端采用羟基荧光素fam标记。

svcv的g基因lamp扩增引物序列位置如图1(f1，f2，f3，b1，b2，b3)注：fip为f2与f1c(f1c为f1互补序列)相连所得，bip为b2与b1c(b1c为b1互补序列)相连所得。

二、lamp扩增及条件优化

1、含svcv特异基因的重组质粒构建：将puc57载体的smai酶切位点间插入svcv特异片段(序列表的序列6所示的双链dna分子，ncbi登录号：ay527273)，得到含svcv特异基因的重组质粒(已经测序验证)。

2、采用步骤1得到的重组质粒作为模板进行扩增条件优化。

首先配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系(表1)。

表1lamp反应体系

表1的缓冲液中各组分及其在反应体系中的浓度为：20mmol/ltris-hcl(ph8.8)、50mmol/lkcl、2mmol/lmgso4、10mmol/l(nh4)2so4和0.1％(体积百分含量)的tween-20。

表1的反应体系中，mgso4的浓度为6mmol/l，svcv-g-fip和svcv-g-bip的浓度均为1.6μmol/l，svcv-g-f3和svcv-g-b3的浓度均为0.2μmol/l，dntps的浓度为1.4mmol/l，bstdna聚合酶的含量为8u。

将上述lamp反应体系在不同反应温度(61℃、63℃、65℃)进行扩增反应40min，之后80℃水浴5min终止反应，通过琼脂糖凝胶电泳法最终确定最佳反应所需温度。

通过实验结果分析最终选择63℃进行扩增反应40min，之后80℃水浴5min终止反应作为后续lamp扩增的最佳反应条件。

三、侧向流动试纸条(lateralflowdipstick，lfd)检测

lamp扩增结束后，向反应管内加入2μl10mmol/l的svcv-g-hp探针(使其在反应管中的终浓度为0.8mmol/l)，63℃杂交5min，得到杂交反应产物。

取10μl杂交反应产物加入到lfd试纸条(杭州优思达生物技术有限公司，试剂盒名称：一次性核酸检测试纸条，货号：d003-03)样品垫上，并在点样处前端加入100μlbuffer溶液(试剂盒中自带)中，静置3-5分钟，观察试纸条检测带是否显色。

如果lfd试纸条质控带(controlline)和检测带(textline)均显色，则表示该样品中svcv的检测结果为阳性，即感染svcv或候选感染svcv，如果仅质控带(controlline)显色，检测带(textline)未显色，则表示该样品svcv的检测结果为阴性，即未感染svcv或候选未感染svcv。

实施例2、lamp-lfd检测svcv灵敏度的评价

1、含svcv特异基因的重组质粒构建：将puc57载体的smai酶切位点间插入svcv特异片段(序列表的序列6所示的双链dna分子，ncbi登录号：ay527273)，得到含svcv特异基因的重组质粒(已经测序验证)提取质粒，得到浓度为8.6ng/μl的dna溶液；

2、10倍梯度稀释步骤1得到的dna溶液，得到各稀释液；

3、取步骤2的各dna稀释液作为模板，分别用lamp、lamp-lfd对svcv进行检测比较灵敏度。以双蒸水为模板作为阴性对照。

在25μl反应体系中，形成如下不同dna初始含量的反应体系：

反应体系1中，初始模板dna含量为：0.86ng(稀释10倍)；

反应体系2中，初始模板dna含量为：86pg(稀释10²倍)；

反应体系3中，初始模板dna含量为：8.6pg(稀释10³倍)；

反应体系4中，初始模板dna含量为：0.86pg(稀释10⁴倍)；

反应体系5中，初始模板dna含量为：86fg(稀释10⁵倍)；

反应体系6中，初始模板dna含量为：8.6fg(稀释10⁶倍)；

反应体系7中，初始模板dna含量为：0.86fg(稀释10⁷倍)。

lamp检测：以上反应体系63℃进行扩增反应40min，之后80℃水浴5min终止反应，得到扩增产物；电泳检测扩增产物。

如果电泳检测有扩增产物，则该样品中svcv的检测结果为阳性，即感染svcv或候选感染svcv，如果电泳检测无扩增产物，则表示该样品svcv的检测结果为阴性，即未感染svcv或候选未感染svcv。

结果见图2所示。图2中，m为200bpdnamarker，泳道0为双蒸水作为模板的阴性对照，泳道1-7依次对应反应体系1-7的结果。结果表明，lamp反应产物量随模板浓度降低而减少，其最低检测模板dna浓度8.6×10^-6ng/μl，即模板含量为8.6fg(稀释10⁶倍)。

lamp-lfd检测：以上反应体系63℃进行扩增反应40min，得到扩增产物；向反应管内加入2μl10mmol/l的svcv-g-hp探针(使其在反应管中的终浓度为0.8mmol/l)，63℃杂交5min，得到杂交反应产物；lfd试纸条检测杂交反应产物。

如果lfd试纸条质控带(controlline)和检测带(textline)均显色，则表示该样品中svcv的检测结果为阳性，即感染svcv或候选感染svcv，如果仅质控带(controlline)显色，检测带(textline)未显色，则表示该样品svcv的检测结果为阴性，即未感染svcv或候选未感染svcv。

结果见图3所示。图2中，0为水作为模板的阴性对照，1-3依次对应反应体系1-3的结果。结果表明，lamp反应产物量随模板浓度降低而减少，检测线颜色逐级变浅，以此方法能够最低检测模板dna浓度8.6×10^-2ng/μl，即模板含量为86pg(稀释10²倍)。

从上述可以看出，本发明的lamp引物探针能够保证检测时的灵敏性。

实施例3、lamp-lfd检测对svcv特异性的评价

1、含svcv特异基因的重组质粒构建：将puc57载体的smai酶切位点间插入svcv特异片段(序列表的序列6所示的双链dna分子，ncbi登录号：ay527273)，得到含svcv特异基因的重组质粒(已经测序验证)。

2、含khv特异基因的重组质粒构建：将puc57载体的smai酶切位点间插入khv特异片段(序列表的序列7所示的双链dna分子，ncbi登录号：ab375390)，得到含khv特异基因的重组质粒(已经测序验证)。

3、含gcrv特异基因的重组质粒构建：将puc57载体的smai酶切位点间插入gcrv特异片段(序列表的序列8所示的双链dna分子，ncbi登录号：hq231204)，得到含gcrv特异基因的重组质粒(已经测序验证)。

4、分别以步骤1-3构建的含svcv特异基因的重组质粒质粒dna、含khv特异基因的重组质粒质粒dna和含gcrv特异基因的重组质粒质粒dna作为模板，分别用lamp、lamp-lfd对svcv进行检测。以双蒸水为模板作为阴性对照。

lamp检测：63℃进行扩增反应40min，之后80℃水浴5min终止反应，得到扩增产物；电泳检测扩增产物。

如果电泳检测有扩增产物，则该样品中svcv的检测结果为阳性，即感染svcv或候选感染svcv，如果电泳检测无扩增产物，则表示该样品svcv的检测结果为阴性，即未感染svcv或候选未感染svcv。

结果见图4所示。图4中，m为200bpdnamarker，泳道0为双蒸水作为模板的阴性对照，泳道1-3依次对应含svcv特异基因的重组质粒质粒dna、含khv特异基因的重组质粒质粒dna和含gcrv特异基因的重组质粒质粒dna为模板的检测结果。结果表明，以svcv为模板的反应呈阳性，而以khv，gcrv为模板的反应呈阴性，以双蒸水为模板的反应也呈阴性。

lamp-lfd检测：63℃进行扩增反应40min，得到扩增产物；向反应管内加入2μl10mmol/l的svcv-g-hp探针(使其在反应管中的终浓度为0.8mmol/l)，63℃杂交5min，得到杂交反应产物；lfd试纸条检测杂交反应产物。

如果lfd试纸条质控带(controlline)和检测带(textline)均显色，则表示该样品中svcv的检测结果为阳性，即感染svcv或候选感染svcv，如果仅质控带(controlline)显色，检测带(textline)未显色，则表示该样品svcv的检测结果为阴性，即未感染svcv或候选未感染svcv。

结果见图5所示。图5中，0为水作为模板的阴性对照，1-3依次对应含svcv特异基因的重组质粒质粒dna、含khv特异基因的重组质粒质粒dna和含gcrv特异基因的重组质粒质粒dna为模板的检测结果。结果表明，以svcv为模板的反应呈阳性，检测线显红色条带，而以khv，gcrv为模板的反应呈阴性，以双蒸水为模板的反应也呈阴性，检测线均无变化。

上述结果表明，本发明提供的svcv的lamp-lfd检测方法能保证只对svcv具有特异性，不与其它水产病毒发生交叉反应。

sequencelisting

<110>北京科弘生物技术有限公司

<120>环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒

<160>8

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaccccaatatataacccacag22

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atcgatccagtgtcctcc18

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<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cagttcctgatgcaatccttgattcatccaatcagtcctacc42

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tcaaagttgcggatgggcatagaatggggtactaccttgt40

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tgaagatctggggtttcccc20

<210>6

<211>1598

<212>dna

<213>鲤春病毒血症病毒

<400>6

aacagacatcatgtctatcatcagctacatcgcattccttttgctaattgactccacatt60

tggaatccccatatttgttccatccgggcagaatatatcatggcaacctgtaattcagcc120

atttgattatcaatgtccaatacacggaaatctacctaacacaatgggattgagtgccac180

caaattgacaataaaatctccatctgtcttcagtacagataaagtttctggatggatctg240

ccatgcagctgaatggaaaacaacttgtgattacagatggtacggaccccaatatataac300

ccacagtattcatccaatcagtcctaccatagatgaatgcaagagaatcatttcaaggat360

tgcatcaggaactgatgaagatctggggtttccccctcaaagttgcggatgggcatctgt420

cacaacagtgtcaaatactaattacaaggtagtaccccattctgttcatttggagccgta480

cggaggacactggatcgatcatgaattcaatgggggcgaatgcagagaaaaagtgtgtga540

aatgaaagggaaccactctatttggatcacagatgagaccgtgcagcatgaatgtgaaaa600

gcacatagaggaagttgaaggaattatgtacgggaatgctccgagaggggatgcaatata660

tattaacaactttattatagataaacatcatagagtatacagattcggggggtcttgtcg720

aatgaaattctgtaataaagatggtataaaattcacaagaggagactgggtagaaaaaac780

agctgaaacattgacgaatatttatgcaaatatacctgaatgtgctgatggaacgttggt840

atctggtcaccgacctggattagacttgattgacacagtcttcaatttggaaaatgtggt900

agaatatactttgtgtgaagggactaaaagaaaaatcaataaccaagaaaagttgacgtc960

agtggatttgagttatttggccccaagaattggagggttcggatcagtattcagagtgag1020

aaacggaacattagagagagggagcactacttatatcaagatagaagtagagggacctat1080

tgtcgactcgttgaatggaacagatccgagaaccaacgcctcaagagtattttgggacga1140

ctgggagttagatggcaatatatatcagggctttaatggtgtatataaagggaaagatgg1200

gaagatccatattcccttgaatatgatagaatcaggaatcatagatgatgaacttcaaca1260

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<213>草鱼呼肠孤病毒

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