本发明涉及微生物培养基技术领域，特别是涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂、培养基及应用。
背景技术：
嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)属嗜热性需氧芽孢杆菌，兼性厌氧，细菌繁殖体g兰氏染色呈紫色，细菌芽孢可孔雀石绿着色。其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。其最低生长温度为28℃，最高生长温度70～77℃。最适生长繁殖温度为56～65℃，培养24h即可形成菌落，37℃下24h看不到菌落。在ph6.8～7.2的培养基中生长良好，当ph值接近5时就不能生长。
嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢无毒、无致病性，对热、放射线和化学物质有很强的抵抗力，尤其对压力蒸汽和过氧化氢的抗力强于大多数微生物，因此在我国、欧美等地区将嗜热脂肪芽孢杆菌作为热力灭菌和过氧化氢低温等离子灭菌的标准菌株。另外，嗜热脂肪芽孢杆菌还被用于检测抗生素残留的标准菌株。
嗜热脂肪芽孢杆菌，包括繁殖体和芽孢体两种形态。在嗜热脂肪芽孢杆菌作为标准菌株进行检测时，需要芽孢萌发生长至菌体繁殖阶段，即生长至繁殖体。传统地，溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂为其繁殖体的特征性培养基，暂无专门针对其芽孢萌发生长培养基的研究报道，而利用溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基进行芽孢培养时，培养周期长，导致利用嗜热脂肪芽孢杆菌进行检测的效率低。
技术实现要素：
基于此，有必要针对用溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基进行芽孢培养时，培养周期长，导致利用嗜热脂肪芽孢杆菌进行检测的效率低的问题，提供一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂、培养基及应用。
本发明提供的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂，其中，每100ml所述培养助剂含有果糖1～20g；dl-色氨酸0.1～10g；谷胱甘肽0.01～5g；对氨基苯甲酸0.1～10mg。
在其中一个实施例中，每100ml所述培养助剂包含黄原胶0.1～10g。
在其中一个实施例中，每100ml所述培养助剂包含牛肉粉0.1～10g。
在其中一个实施例中，所述培养助剂经无菌滤器过滤处理。
本发明还提供一种如上所述的培养助剂的应用，所述培养助剂添加至用于培养嗜热脂肪芽孢杆菌的培养基中。
本发明还提供一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基，所述培养基包括培养基体以及如上所述的培养助剂，每1000ml所述培养基体中含有蛋白胨5～20g，葡萄糖1～20g以及溴甲酚紫乙醇溶液0.3～1ml。
在其中一个实施例中，每1000ml所述培养基中所述培养助剂为1～20ml。
在其中一个实施例中，每1000ml所述培养基体中含有琼脂3.0～20g。
在其中一个实施例中，所述培养助剂在所述培养基使用前加入所述培养基体。
本发明还提供了一种如上所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基的应用，所述培养基应用于抗生素残留检验或消毒与灭菌效果的评价。
上述嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂，培养助剂中含有的果糖、dl-色氨酸、谷胱甘肽以及对氨基苯甲酸，能够协同促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢加快萌发，并提高萌发率，缩短嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发时间，提高利用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢作为标准菌株时的工作效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂、培养基及应用进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂，每100ml培养助剂含有果糖1～20g；dl-色氨酸0.1～10g；谷胱甘肽0.01～5g；对氨基苯甲酸0.1～10mg。
本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养助剂中含有的果糖、dl-色氨酸、谷胱甘肽以及对氨基苯甲酸，能够协同促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢加快萌发，提高萌发速率，缩短嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发时间，提高利用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢作为标准菌株时的工作效率。
进一步地，培养助剂以上述配比添加果糖、dl-色氨酸、谷胱甘肽以及对氨基苯甲酸，各组分之间能够更好地促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发，避免某一组分过量或过少影响嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发效率。
进一步地，每100ml培养助剂包含黄原胶0.1～10g。通过添加黄原胶，能够增加培养基的粘稠度以及感官通透性，提高检测结果判读效率，有效避免检测物质的背景颜色或杂质的干扰。
进一步地，每100ml培养助剂包含牛肉粉0.1～10g。牛肉粉能够补充并丰富嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢萌发所需的氨基酸及矿物质，能够进一步提高嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发率。
进一步地，培养助剂经无菌滤器过滤处理。通过无菌滤器过滤处理，能够使培养助剂无菌，避免带入杂菌影响嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发以及影响检测的进行。更进一步地，采用无菌滤器过滤处理能够避免高温高压灭菌破坏培养助剂中的组分，使其更好地协同发挥作用。
本发明还提供一种上述培养助剂的应用，培养助剂添加至用于培养嗜热脂肪芽孢杆菌的培养基中。本发明的培养助剂直接添加至现有的用于培养嗜热脂肪芽孢杆菌的培养基中，无需对现有的培养基进行改进，能够利用现存的培养基，并加快嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在培养基中的萌发效率，缩短培养时间。
本发明还提供一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基，培养基包括培养基体以及如上述培养助剂，每1000ml所述培养基体中含有蛋白胨5～20g，葡萄糖1～20g以及溴甲酚紫乙醇溶液0.3～1ml。
本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基，含有上述培养助剂，能够利用培养助剂中的果糖、dl-色氨酸、谷胱甘肽以及对氨基苯甲酸协同促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢加快萌发，并提高萌发效率，缩短嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发时间，提高利用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢作为标准菌株时的工作效率。
可选地，溴甲酚紫乙醇溶液的溴甲酚紫浓度为2％。
进一步地，每1000ml所述培养基中所述培养助剂为1～20ml。通过加入培养基总量的0.1％～2％的培养助剂，该培养助剂就能够发挥提高萌发效率的作用，培养助剂用量少，在促进萌发效率的同时几乎不会增加培养基的成本。
进一步地，每1000ml所述培养基体中含有琼脂3.0～20g份。通过添加适量的琼脂，能够使培养基呈固态，以满足固态培养基的需求。
进一步地，培养助剂在培养基使用前加入培养基体。使用前将培养助剂加入培养基体中并混合使用，一方面避免过早加入培养助剂使培养助剂的有效成分失效，另一方面可通过低廉方便的高温高压方法对培养基体进行灭菌以便使用。例如，可以是将培养基体于115℃高压灭菌30min后备用，使用前加入无菌滤器处理过的培养助剂，以确保形成的培养基无菌。
本发明还提供了一种上述嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基的应用，培养基应用于抗生素残留检验或消毒与灭菌效果的评价。
在鲜乳中抗生素残留检验中，嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基的应用原理如下：
将含有嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢和溴甲酚紫指示剂的培养基加入待检样本并于65℃孵育后，若样本中不含抗生素或抗生素的浓度低于检测限，芽孢将在培养基中生长并产酸，ph指示剂的颜色变为黄色。相反，如果样本中含有高于检测限的抗生素，则芽孢不会生长，ph指示剂的颜色保持紫色不变。
在消毒与灭菌效果的评价中，嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢培养基的应用原理为：嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢耐高温，当灭菌条件达到121℃、20min时可将其杀死。若灭菌条件不达标，灭菌后的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢未完全杀死，接种入含有溴甲酚紫指示剂的培养基65℃孵育后，芽孢将会在培养基中生长产酸，ph指示剂的颜色变为黄色。相反，若灭菌条件达标，芽孢将全部被杀死，ph指示剂的颜色保持紫色不变。
传统地，抗生素残留检验和消毒与灭菌效果的评价的检验方法中，是在蒸馏水中加入蛋白胨、葡萄糖搅拌至完全溶解，若需制备固体培养基则另外加入琼脂进行加热溶解，溶解后调节ph至7.0～7.2，然后再加入2％溴甲酚紫乙醇溶液，混匀后，115℃高压灭菌30～40min。
按照上述方法配置的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂培养基适合嗜热脂肪芽孢杆菌营养体的生长繁殖，在进行嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢萌发培育时则需较长的培养时间，经多次实验证明，菌落添加浓度为5×105cfu的情况下，培养基变色的时间需要4～6h。
而培养基中添加本发明的培养助剂后，或采用本发明的培养基进行嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢萌发培育时，在菌落添加浓度均为5×105cfu的情况下，培养基变色的时间缩短至2～3h。说明本发明的培养助剂能够明显缩短嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发时间，进而减少利用嗜热脂肪芽孢杆菌进行的检测工作时间。
实施例1
将2gdl-色氨酸，0.05g谷胱甘肽，0.02g对氨基苯甲酸，4g黄原胶加热混匀后，加入20g果糖、2g牛肉粉，加水定容至100ml，搅拌溶解制得混合液，将上述混合液用0.22um无菌滤器进行过滤除菌，制得培养助剂。
在800ml蒸馏水中加入10.0g蛋白胨、5.0g葡萄糖、4.0g琼脂，加热搅拌至完全溶解，调节ph至7.1±0.1，然后再加入2％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml，混匀后，定容至990ml，115℃高压灭菌30min，自然冷却至60℃，制得培养基体。
向冷却至60℃的培养基体中添加10ml的培养助剂混匀，制得培养基。
在培养基中添加嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬液至以芽孢最终浓度为5×105cfu，在无菌5ml离心管中加入含有芽孢悬液的培养基0.2ml，制得检测培养管，垂直放置冷却至室温后保存备用。
以10％灭菌脱脂奶粉溶液作为阴性样本，以含有青霉素g10ug/l的10％脱脂奶粉溶液为阳性样本，在第一组三个检测培养管中分别添加0.1ml阴性样本、在第二组三个检测培养管中分别添加0.1ml阳性样本。将第一组以及第二组的检测培养管置于56℃恒温培养箱中恒温培养。阴性样本完全变黄时间为2.5h，阳性样本检测管为紫色。
检测培养管存放两周后，进行上述恒温培养实验，阴性样本完全变黄时间为2.75h，阳性样本检测管为紫色。
检测培养管存放四周后，进行上述恒温培养实验，阴性样本完全变黄时间为2.75h，阳性样本检测管为紫色。
对照例1
在800ml蒸馏水中加入10.0g蛋白胨、5.0g葡萄糖、4.0g琼脂，加热搅拌至完全溶解，调节ph至7.1±0.1，然后再加入2％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml，混匀后定容至1l。115℃高压灭菌30min。自然冷却至60℃，制得培养基。
在培养基中添加嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬液至以芽孢最终浓度为5×105cfu，在无菌5ml离心管中加入含有芽孢悬液的培养基0.2ml，制得检测培养管，垂直放置冷却至室温后保存备用。
以10％灭菌脱脂奶粉作为阴性样本，以含有青霉素g10ug/l的10％脱脂奶粉为阳性样本，在第一组三个检测培养管中分别添加0.1ml阴性样本、在第二组三个检测培养管中分别添加0.1ml阳性样本。将第一组以及第二组的检测培养管置于56℃恒温培养箱中恒温培养。阴性样本完全变黄时间为4h，阳性样本检测管为紫色。
检测培养管存放二周后，进行上述恒温培养实验，阴性样本完全变黄时间为5h，阳性样本检测管为紫色。
检测培养管存放四周后，进行上述恒温培养实验，阴性样本完全变黄时间为6h，阳性样本检测管为紫色。
对比实施例1与对照例1的实验结果的实验结果能够发现，采用本发明的培养助剂/培养基，能够有效提高嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发生长速率，并能保证嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在培养基中的保存稳定性，大幅度改善芽孢产业化的应用效率。
实施例2
将2gdl-色氨酸，0.05g谷胱甘肽，0.02g对氨基苯甲酸，4g黄原胶加热混匀后，加入20g果糖、2g牛肉粉，加水定容至100ml，搅拌溶解制得混合液，将上述混合液用0.22um无菌滤器进行过滤除菌，制得培养助剂。
在800ml蒸馏水中加入10.0g蛋白胨、5.0g葡萄糖，加热搅拌至完全溶解，调节ph至7.1±0.1，然后再加入2％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml，混匀后，定容至990ml，115℃高压灭菌30min，自然冷却至60℃，制得培养基体。
向冷却至60℃的培养基体中添加10ml的培养助剂混匀，制得培养基。用灭菌离心管按5ml/管分装包口，制得检测培养管备用。
在检测培养管中添加嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢至以10ml培养基计算嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢最终浓度为1cfu，作为阳性样本。
将含菌量为5×105cfu嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢菌片于121℃下高压灭菌20min，制得灭菌片，将灭菌片置于培养检测管中，作为待测样本。
将阳性样本以及待测样本置于56℃恒温培养箱中恒温培养。
阳性样本的变黄时间为24h，含灭菌片的待测样本为紫色。
对照例2
在800ml蒸馏水中加入10.0g蛋白胨、5.0g葡萄糖，加热搅拌至完全溶解，调节ph至7.1±0.1，然后再加入2％溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml，混匀后定容至1l，115℃高压灭菌30min后备用，自然冷却后用灭菌离心管按5ml/管分装包口，制得检测培养管备用。
在检测培养管中添加嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢至以10ml培养基计算嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢最终浓度为1cfu，作为阳性样本。
将含菌量为5×105cfu嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢菌片于121℃下高压灭菌20min，制得灭菌片，将灭菌片置于培养检测管中，作为待测样本。
将阳性样本以及待测样本置于56℃恒温培养箱中恒温培养。
阳性样本的变黄时间为48h，含灭菌片的待测样本为紫色。
对比实施例2与对照例2的实验结果的实验结果能够发现，采用本发明的培养助剂/培养基，能够提高嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发生长速率，即使在嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢较少的情况下，也能够有效提高嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的萌发生长速率，改善芽孢产业化的应用效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。