一种施万细胞的提取纯化和培养方法与流程

本发明涉及一种施万细胞的提取纯化和培养方法。

背景技术：

原代培养的施万细胞不仅是研究施万细胞功能和周围髓鞘生物学的基础，也是神经组织工程的重要种子细胞。周围神经系统中的神经胶质细胞称施万细胞，它沿神经元的突起分布。施万细胞包裹在神经纤维上，这种神经纤维叫有髓神经纤维。有髓神经纤维和无髓神经纤维的施万细胞的形态和功能有所差异，施万细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成。未成熟的施万细胞可以受到微环境的剌激而再次启动分化。在脊髓横断损伤、肌肉萎缩性侧面硬化病等疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤。

目前，研究人员已经摸索出诱导大鼠坐骨神经组织来源的施万细胞的培养方法(wangy,zhous,xuh,yans,xud,zhangy.upregulationofnf45correlateswithschwanncellproliferationaftersciaticnervecrush.molneurosci.2015may；56(1):21627.)。但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的施万细胞分离纯化和培养方法中均存在神经获取量低、且成纤维细胞残留量大的问题，最终不利于施万细胞的原代培养和扩增，所得施万细胞的数量少、活性差。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种施万细胞的提取纯化和培养方法。从新生spraguedawly(sd)大鼠椎管椎间孔提取周围神经进行原代培养，获得稳定传代的高纯度施万细胞。

本发明的目的在于提供一种施万细胞的提取纯化和培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种施万细胞的分离纯化和培养方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；

2)剪断臂丛神经和坐骨神经；

3)剪开椎板露出脊髓；

4)扯去脊髓；

5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；

6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；

7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；

8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含fbs的dmem/f12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24-26h后，加入含fbs和arac的dmem/f12培养液，混匀，45～50h后，用sc培养基替换含fbs和arac的dmem/f12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。

进一步的，步骤1)中，在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经和坐骨神经。

进一步的，步骤5)中，所述周围神经包括臂丛神经、肋间神经和坐骨神经。

进一步的，步骤6)中，剥离残余的血管及结缔组织是在hbss溶液浸泡中进行剥离。

进一步的，步骤7)中，周围神经切割成小段的长度为0.5～1mm。

进一步的，步骤7)中，所述含胰蛋白酶的消化液为0.2％～0.3％胰蛋白酶-edta溶液。

进一步的，步骤7)中，所述消化反应的温度为36.5～37.5℃，消化反应的时间为25～40min，且每隔8～12min震荡一次。

进一步的，步骤8)中，所述离心的离心力为100～120g，时间为8～12min。

进一步的，步骤8)中，所述含fbs和arac的dmem/f12培养液中fbs的浓度为9.5～10.5％w/v，arac的浓度为9.5～10.5μm。

进一步的，步骤8)中，所述sc培养基为含2.8～3.2％fbs、2.8～3.2μm毛喉素、9～11ng/ml重组人heregulinβ-1以及0.8～1.2％青霉素/链霉素的dmem/f12培养液。

本发明的有益效果是：

(1)本发明方法从椎管椎间孔所抽取神经不含有神经外膜，成纤维细胞的残留量低。

(2)本发明方法与常规剪取坐骨神经培养法相比，本方法从椎管椎间孔抽取出周围神经(包括臂丛神经，肋间神经和坐骨神经)，可以获得常规方法6-8倍的神经量，且成纤维细胞的残留量明显降低，有利于施万细胞的培养和扩增。

附图说明

图1为分离大鼠周围神经的操作过程；

图2为显微镜观察施万细胞形态(图2-a和图2-a’)、免疫荧光染色鉴定细胞表达施万细胞标志物s100(图2-b)、gfap(图2-c)和p75(图2-d)蛋白、以及通过dapi(图2-b’、2-c’、2-d’)对细胞核进行染色。

具体实施方式

一种施万细胞的分离纯化和培养方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；

2)剪断臂丛神经和坐骨神经；

3)剪开椎板露出脊髓；

4)扯去脊髓；

5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；

6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；

7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；

8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含fbs的dmem/f12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24-26h后，加入含fbs和arac的dmem/f12培养液，混匀，45～50h后，用sc培养基替换含fbs和arac的dmem/f12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。

优选的，步骤1)中，在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经和坐骨神经。

优选的，步骤5)中，所述周围神经包括臂丛神经、肋间神经和坐骨神经。

优选的，步骤6)中，剥离残余的血管及结缔组织是在hbss溶液浸泡中进行剥离。

优选的，所述hbss溶液为在1～7℃预冷的溶液。

优选的，步骤7)中，周围神经切割成小段的长度为0.5～1mm。

优选的，步骤7)中，所述含胰蛋白酶的消化液为0.2％～0.3％胰蛋白酶-edta溶液。

优选的，步骤7)中，所述消化反应的温度为36.5～37.5℃，消化反应的时间为25～40min，且每隔8～12min震荡一次。

优选的，步骤8)中，所述过滤用孔径为80～120μm的细胞过滤器进行过滤。

优选的，步骤8)中，所述离心力为100～120g，时间为8～12min。

优选的，步骤8)中，所述含fbs的dmem/f12培养液中fbs的浓度为9.5～10.5％w/v。

优选的，步骤8)中，所述含fbs和arac的dmem/f12培养液中fbs的浓度为9.5～10.5％w/v，arac的浓度为9.5～10.5μm。

优选的，步骤8)中，所述sc培养基为含2.8～3.2％fbs、2.8～3.2μm毛喉素、9～11ng/ml重组人heregulinβ-1以及0.8～1.2％青霉素/链霉素的dmem/f12培养液。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明使用的化学物质材料为：

新生sd大鼠(出生后2-4天，p2-4)；

蒸馏水；

75％乙醇；

hank的平衡盐溶液(hbss)(thermofisherscientific，gibcotm，目录编号：c14175500bt)；

多聚赖氨酸(pll)氢溴酸(sigmaaldrich目录编号：p1274)；

0.25％胰蛋白酶-edta(thermofisherscientific，gibcotm，目录编号：25200-072)；

胎牛血清(fbs)(corning，目录编号：35-076-cv)；

dmem/f12(corning，目录编号：r10-092-cv)；

阿糖胞苷(arac)(sigmaaldrich目录编号：c1768)；

毛喉素(sigmaaldrich，目录编号：f6886)；

重组人heregulinβ-1(目录编号：100-03)；

二甲基亚砜(dmso)(mpbiomedicals，目录编号：196055)；

青霉素/链霉素(笔/链球菌)(thermofisherscientific，gibcotm，目录编号：15140-122)；

磷酸盐缓冲液(pbs)(碧云天，目录编号：c0221a)；

多聚甲醛(pfa)(广东光华科技、目录号：1.17767.014)；

明胶(sigmaaldrich，目录编号：g7041)；

tritonx-100(sigmaaldrich，目录编号：v900502)。

实施例1一种施万细胞的提取纯化和培养方法

(1)实验前准备：

0.1mg/ml的pll蒸馏水溶液1ml，浸泡35mm培养皿，细胞培养箱内37℃过夜；吸干pll蒸馏水溶液，蒸馏水冲洗两次，在紫外线照射下晾干30分钟；

准备50mlhbss，在4℃预冷；

用75％乙醇浸泡30分钟消毒剪刀和镊子，然后在紫外线照射下晾干30分钟；

紫外消毒手术操作台。

(2)分离皮肤和肌肉：将经75％乙醇皮肤消毒过的新生sd大鼠固定成标本形状，腹侧面向下(如图1-a)；解剖剪分离背部皮肤(如图1-b)，逐层分离肌肉(如图1-c)；

(3)剪断臂丛神经和坐骨神经：先在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经(图1-c、d)和坐骨神经(图1-e)；

(4)剪开椎板露出脊髓：再用眼科剪剪开椎板暴露出脊髓(如图1-f)，图1-f’为剪开椎板暴露出脊髓的模式图；

(5)去脊髓：配合眼科剪和显微镊，完整扯去全段脊髓(图1-g)

(6)抽取周围神经：去除脊髓之后，能够明显看到各个节段的椎间孔，内有剩余的周围神经(如图1-h所示)，图1-i为脊髓和周围神经分布的模式图；配合显微剪和显微镊，从各个椎间孔抽取出周围神经(图1-j)，包括臂丛神经，肋间神经和坐骨神经；

(7)将所获得神经浸泡在4℃预冷的hbss溶液中，用显微镊剥离残余的血管及结缔组织，如图1-k中箭头所示的部位，剥离残余血管及结缔组织后的神经如图1-l所示。与常规方法相比，本方法从脊髓位置所抽取神经不含有神经外膜，成纤维细胞的残留量大大降低，同时可以获得常规方法6-8倍的神经量，有利于后续施万细胞的培养和扩增。

(8)单细胞悬液的制备：将所获得神经切割成长度为0.5-1mm的小段，将切割的神经转移到0.25％胰蛋白酶-edta溶液中，37℃水浴30分钟，每隔10分钟震荡一次；用100μlfbs终止消化，然后用研磨棒研磨神经组织，制作成单细胞悬液；

(9)施万细胞的培养和扩增：将上步单细胞悬液通过孔径为100μm的细胞过滤器除去残留的团块；细胞悬液以100～120g离心力离心10分钟，弃上清。用含10％fbs的dmem/f12培养液1.5ml，重新悬浮细胞，并将其滴加在pll处理过的35mm培养皿中；24～26小时后，将含10％fbs同时含有10μmarac的dmem/f12培养液1ml加入到培养皿中，混匀，此培养液中施万细胞不增殖，而增殖的成纤维细胞等非施万细胞会被arac的抗代谢作用杀死；48小时后，用sc培养基(含3％fbs、3μm毛喉素、10ng/ml重组人heregulinβ-1以及1％青霉素/链霉素的dmem/f12培养液)替换含10％fbs同时含有10μmarac的dmem/f12培养液，继续扩增施万细胞；即可。

下面对本发明制得的施万细胞作进一步的效果检测。

一、细胞形态检测

取扩增后的施万细胞种植在细胞爬片上，显微镜观察细胞形态可见呈双极梭形型、且形态规则均一(图2-a和图2-a’)，从形态上说明了本发明方法制得的细胞的确为施万细胞。

二、细胞数量检测

本方法在5天后就可以获得大量稳定传代的施万细胞，与常规方法相比明显节省了时间，如常规的剪取坐骨神经培养施万细胞的方法，5天后可获得施万细胞约0.2×10⁶个/只老鼠(参考文献：kimha,maurelp.primaryschwanncellcultures[m]//protocolsforneuralcellculture.humanapress,2009:253-268)，而本发明方法在5天可获得施万细胞约1.6×10⁶个/只老鼠。

三、纯度检测

通过免疫荧光染色鉴定可见细胞表达施万细胞标志物s100(图2-b)、gfap(图2-c)和p75(图2-d)蛋白。通过dapi(图2-b’、2-c’、2-d’对所有细胞的细胞核进行染色，统计得施万细胞纯度高达98％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。