本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及一种人类脐带血造血干细胞(umbilicalcordbloodhematopoieticstemcells，ucb-hsc)高效扩增自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)的方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)，是机体内天然免疫第一道防线，其在外周血中含量仅为10％-20％。它具有高效抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能，在防御机体疾病中发挥着重要作用。自然杀伤细胞具有不受组织兼容性抗原限制，即杀伤活性无mhc限制。细胞具有广谱杀毒性，且不需要抗原递呈细胞启动即可直接进攻癌细胞。自然杀伤细胞通过直接溶解、释放穿孔素和分泌细胞因子两个方面进行杀瘤。细胞可以分泌tnf-ɑ、ifn-γ和il-1细胞因子。这些细胞因子在调节淋巴细胞发挥免疫功能起着重要作用。科学研究表明，自然杀伤细胞具有调节免疫功能和神经系统相互作用能力。理论上这种细胞可以成为高效治疗癌症免疫疗法。
人体每天有数十亿细胞死亡和再生，由于外界污染等因素，细胞复制时产生错误的概率非常高，因此免疫系统对各种错误监控十分重要。随着年龄增高，免疫力逐渐下降。当年龄25岁时，细胞活力和数量达到最大值。当年龄25-55之间时，细胞活力和数量处于最优，当年龄超过55岁时，细胞活性和数量呈现下降趋势。当机体免疫力低下时，细胞数量和活性随之降低，可能直接或间接导致疾病和肿瘤发生。
肿瘤生物治疗是继三大传统治疗手段(放射治疗、化学治疗、手术治疗)之后出现的一种新兴肿瘤治疗模式，在肿瘤治疗中发挥了重要作用。晚期肿瘤患者各项生理指标均较差，不宜进行手术，放射治疗、化学治疗会给患者带来较大的不良反应，增加患者痛苦。肿瘤生物治疗作为常规肿瘤治疗手段的补充，为晚期肿瘤患者提供了更好的治疗选择。
肿瘤生物治疗是抽取患者体内外周血，运用细胞生物学方法体外进行增值后回输到患者体内的方法。回输后细胞可以激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。但研究发现，有些早期自体nk细胞输注并没有起到理想的治疗疾病效果，可能是由于nk细胞通过识别自身抑制性nk细胞受体而出现免疫耐受，因此异源性nk细胞输注越来越多地尝试作为一个新的免疫治疗受到各界关注，因此，研究中找到异体高活性免疫细胞，并建立质量稳定、足够数量、高纯度和杀瘤活性强培养方法成为亟待解决问题。
脐带血(ucb)中富含造血干细胞(hscs)，是除骨髓和外周血之外的第3种hscs的重要来源，其来源广泛，操作方便，免疫原性低，在适宜条件下，hscs可以在体内和体外分化为自然杀伤(nk)细胞。所以，在患者自身免疫低下，不适宜提供细胞种子来源的情况下，脐带血来源成为了首选。
目前国内体外培养脐带血来源nk细胞方法主要有以下几种方法：一种是采用滋养层细胞扩增nk细胞方法，即将单个核细胞与肿瘤细胞株hfwt混合培养诱导扩增nk细胞，此方法虽然可以大大增强nk细胞杀瘤性和增值率，但由于在培养过程中引入了肿瘤细胞，虽经过致死剂量的γ-射线照射，如果发生存活的滋养层细胞随细胞一起进入人体，就会存在安全隐患。另一种采用免疫磁珠对脐带血中单个核细胞进行细胞分选后再扩增的方法，这种方法分离出的细胞虽然纯度较高，但大大增加了研究成本，而且因为缺乏成熟的分选后体外培养工艺，所以很难在体外扩增，无法满足临床回输所需的细胞数量。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人类脐带血造血干细胞高效扩增nk细胞的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种人类脐带血中造血干细胞高效扩增nk细胞的方法，包括如下步骤：
(1)采集新鲜人脐带血80ml置于50ml离心管中，按照脐带血∶hes＝4∶1的比例加入hes，充分混匀，400rpm/5min离心，离心结束后，将上层白细胞和血浆转移到新离心管中，弃掉红细胞；另一新离心管中预置15ml淋巴细胞分离液，缓慢加入2倍体积去除红细胞后的脐带血，20℃，1600rpm/30min离心(升5降3)。离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50ml离心管，56℃灭活30～60min，灭活结束，3000rpm/10min离心，过70um膜，备用；将中间单个核细胞层转移至新50ml离心管，用pbs定容到45ml，1200rpm/8min离心2次，收集沉淀，得到造血干细胞；将造血干细胞接种至包被cd3/cd28t细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度达到5％，记为d0天。
(2)d2天，向培养瓶中补加1ml人血白蛋白为细胞生长提供营养，经研究发现，此操作可提高所培养细胞的纯度。
(3)d3天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的培养瓶中，加入扩增培养基和血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度达到10％。
(4)在d5天和d7天分别向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆，使培养瓶中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在10％。
(5)在d9天向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆/人血白蛋白，使体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在10％。
(6)在d11天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和血浆/人血白蛋白，使体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在5％。
(7)在d14天后对细胞悬液进行采样细胞计数，当连续两天计数结果变化不大于10％时，可以进行细胞收集。
期间，可依据补液量选择更换更大规格的细胞培养瓶或细胞培养袋，可选地，例如t175细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋。
进一步地，本发明经试验发现，步骤(1)诱导细胞时的培养温度对细胞增殖存在影响。经试验探究后，本发明提供一种优选的细胞诱导条件，即步骤(1)中将培养瓶先置于39℃、5％co2的条件下培养18小时，再置于37℃、5％co2的条件下继续培养。
进一步地，d1天及之后，培养条件均为37℃、5％co2。
其中，步骤(1)中所述的刺激液为含有26ml/lt细胞扩增添加剂、20ml/ll-谷氨酰胺和100u/mlok-432的t细胞扩增基础培养基。所述t细胞扩增基础培养基为市售可得商品，例如，可购自stl公司。
本发明所述的hes为羟乙基淀粉，市售可得；所述淋巴细胞分离液市售可得；所述血浆为自体血浆。
本发明所述的包被cd3/cd28t细胞激活剂的培养瓶为：用pbs稀释cd3/cd28t细胞激活剂，包被t75培养瓶，cd3/cd28t细胞激活剂浓度为15-25μg/ml(优选为20μg/ml)，4℃过夜，吸弃培养瓶中pbs，4℃冰箱放置3个月可用。所述培养瓶优选为t75培养瓶。进一步地，所述cd3/cd28t细胞激活剂为市售可得商品，例如，stemcell公司。
作为优选，本发明所述的扩增培养基的配制为：在eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa(辅酶a)浓度100单位/l和atp浓度2mg/l。
其中，所涉及到的eali515-nk培养基为市售可得商品，例如，csi公司。
进一步优选，在步骤(3)及其以后，补加扩增培养基和血浆的同时，还补加人血白蛋白，使其体积浓度维持为15ml/l。该操作可以保持nk细胞比例不会有较大改变。
进一步地，在实际收集细胞时，还需对步骤(7)所述的细胞悬液进行收集，具体步骤为：将上述细胞悬液1200rpm/6min离心，离心结束后弃上清，将沉淀细胞打散，用pbs定容后1200rpm/6min离心洗细胞，重复操作一次；用生理盐水定容后再次1200rpm/6min离心，离心结束后，沉淀细胞用生理盐水重悬。过70um滤膜，将过滤后的细胞悬液打入到生理盐水中，待用。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了人类脐带血中造血干细胞高效扩增nk细胞制备方法。并通过采用不同培养基类型和血浆浓度对脐带血中nk细胞进行培养，筛选出了最佳的培养基种类和最佳的血浆浓度培养方案，通过本发明研究方法使体外扩增得到的nk细胞在细胞活性、细胞数量、纯度和杀伤活性等方面具有显著优势。
本发明培养得到的nk细胞质量稳定、增殖率高、纯度高、杀瘤活性强。所述方法具有易于操作、质量可控、成本低特点。
应用本发明提供的制备方法对脐带血中nk细胞进行体外大规模培养，细胞数量、纯度、杀瘤性均可以满足临床需求，为肿瘤患者和亚健康患者过继免疫治疗提供了异体回输切实可行方法。
本发明利用从脐带血中富集到的cd34+hscs进行体外培养，加入相应细胞因子诱导其分化为nk细胞，并对诱导分化的nk细胞免疫表型及杀伤功能进行检测，为研究不同发育阶段的nk细胞的相应功能及其临床应用提供实验参考。
本发明不仅具有较好的安全性，而且操作简单、质量稳定、技术成本低廉，适用于大规模培养和肿瘤临床治疗。本发明还确定脐带血体外诱导增殖nk细胞最优培养基和培养方法，为细胞过继免疫治疗提供了较优方案。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1不同诱导温度对体外nk细胞扩增影响
(1)采集新鲜人脐带血80ml置于50ml离心管中，按照脐带血∶hes＝4∶1的比例加入hes，充分混匀，400rpm/5min离心，离心结束后，将上层白细胞和血浆转移到新离心管中，弃掉红细胞；另一新离心管中预置15ml淋巴细胞分离液，缓慢加入2倍体积去除红细胞后的脐带血，20℃，1600rpm/30min离心(升5降3)。离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50ml离心管，56℃灭活30～60min，灭活结束，3000rpm/10min离心，过70um膜，备用；将中间单个核细胞层转移至新50ml离心管，用pbs定容到45ml，1200rpm/8min离心2次，收集沉淀，得到造血干细胞；将造血干细胞接种至包被cd3/cd28t细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度达到5％，记为d0天。
(2)d2天用移液管抽取1ml人血白蛋白于培养瓶中。
(3)d3天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的包被cd3/cd28t细胞激活剂的培养瓶中，加入扩增培养基和血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度达到10％；
所述扩增培养基的配制：eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度100单位/l和atp浓度2mg/l。所涉及到的eali515-nk培养基为市售可得商品，例如，可购自csi公司。
(4)在d5天和d7天分别向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆，使培养瓶中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在10％；
(5)在d9天向细胞悬液中补加扩增培养基和血浆，使体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在10％；
(6)在d11天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和血浆，使体系中的细胞密度达到2.0×106个/ml、血浆的体积浓度维持在5％；
(7)在d14天后对细胞悬液进行采样计数、流式检测和细胞杀瘤性测定。当连续两天计数结果变化不大于10％时，可以进行细胞收集。将各组细胞悬液分别转移到250ml离心桶，然后混匀，抽取2ml细胞悬液于冻存管中进行计数、流式细胞仪检测和k562杀瘤性检测。余下细胞悬液1200r/6min离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再用pbs定容1200r/6min离心。重复清洗细胞一次。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水定容到100ml，1200r/6min离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水重悬细胞，过70um细胞筛，将细胞悬液打入到生理盐水中备用。
经3次重复性实验发现，不同诱导温度对脐带血nk细胞纯度存在影响。研究结果见表1，当d0天进行细胞诱导时，选择39℃、5％co2的条件下培养18小时，然后再置于37℃、5％co2的条件下继续培养，其细胞纯度、杀瘤性高于细胞培养瓶始终置于37℃、5％co2的条件下培养。其细胞活性、数量上并无明显差异。其中细胞纯度高达85.87％、杀瘤性高达85％，这可能是由于39℃、5％co2的条件下诱导18小时对细胞进行优选，所以细胞纯度、杀瘤性较高，而其他无明显差异。所以本发明体外诱导增殖脐带血nk细胞的最优培养条件为将细胞培养瓶先置于39℃、5％co2的条件下培养18小时，以后全部置于37℃、5％co2的条件下继续培养。进一步的，本发明研究中发现体外增值脐带血nk细胞过程中，不同培养基类型和血浆浓度对nk细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性均存在影响。
表1不同诱导温度对体外nk细胞扩增影响
实施例2不同人血白蛋白浓度对体外nk细胞扩增影响
本实施例与实施例1的区别在于，在步骤(3)及以后步骤中，补加扩增培养基和血浆的同时，还补加人血白蛋白，使其体积浓度维持为15ml/l。
本研究分别收集d7、d9、d11、d14天细胞悬液进行流式检测，相比实施例1，本实施例能够保证nk细胞纯度不发生较大改变，结果见表2。
表2不同人血白蛋白浓度对体外nk细胞扩增影响
对比例1不同培养基类型对体外nk细胞扩增影响
采取12名健康产妇新鲜脐带血，产妇经临床评估无血液系统疾病和严重自身免疫性疾病。
本对比例与实施例1的区别在于，
使用以下扩增培养基替换实施例1所述的扩增培养基：
扩增培养基a：eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml和il-15浓度25ng/ml。
扩增培养基b：eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度150单位/l和atp浓度1.5mg/l。
扩增培养基c：eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度50单位/l和atp浓度2.5mg/l。
扩增培养基d：nk-ex培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度100单位/l和atp浓度2mg/l。
经3次重复性实验发现，不同培养基种类对脐带血nk细胞增殖成自然杀伤细胞存在影响。研究结果见表3，当d3天解除刺激后，使用该培养基类型(eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度100单位/l和atp浓度2mg/l)可以高效扩增脐带血中nk细胞，经过与实施例1的对比可知，使用本发明所提供扩增培养基高效扩增脐带血中nk细胞时，其细胞数量、纯度、杀瘤性上远远高于本对比例中的扩增培养基。其中细胞杀瘤性高达85％、细胞数达到40×108个、细胞比例高达85.87％。所以本发明体外诱导增殖脐带血nk细胞的最优培养基类型为eali515-nk培养基中添加il-2浓度700u/ml、il-15浓度25ng/ml、coa浓度100单位/l和atp浓度2mg/l。进一步的，本发明研究中发现体外增值脐带血nk细胞过程中，不同浓度血浆对nk细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性存在影响。
表3不同培养基类型对体外nk细胞扩增影响
对比例2不同浓度血浆对nk细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性影响
采取9名健康产妇新鲜脐带血，产妇经临床评估无血液系统疾病和严重自身免疫性疾病。
本对比例与实施例1的区别在于，采用不同浓度血浆对nk细胞进行扩增，具体如下：
方法一：d3天解除刺激后，血浆浓度为10％，d5天和d7天血浆浓度为10％，d9天血浆浓度变为10％，d11天后血浆浓度降到5％。
方法二：b组细胞d3天解除刺激后，血浆浓度为20％，d5天和d7天血浆浓度为20％，d9天血浆浓度为5％，d11天后血浆浓度维持在5％。
方法三：d3天解除刺激后，血浆浓度为10％，此后血浆浓度均为10％。
本发明探究了3组对比实验，经3次重复性实验发现，不同浓度血浆对脐带血nk细胞状态、活性、数量、纯度和杀瘤性存在影响。研究结果见表4，由表4可以看出，研究中采用方法一培养出nk细胞的杀瘤性、纯度远远高于其它两种方法。其中杀瘤性高达80％，细胞比例高达85.37％。本研究得出实验中采用方法一进行脐带血nk细胞培养可以高效提高细胞杀瘤性和纯度，为异体细胞免疫治疗提供了理论依据、奠定了实验基础。
表4不同血浆浓度对体外nk细胞扩增影响
前述nk细胞杀瘤活性的检测方法为：
收集对数生长期细胞以k562细胞为靶细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml细胞为效应细胞，根据不同的效靶比分别调整细胞浓度为1.5×105个/ml、1×106个/ml。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)将效应细胞和靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置于37℃、饱和湿度培养箱中培养12小时后，每孔加入10ulcellcountingkit8，混匀，于37℃饱和湿度培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定450nm波长处值。细胞毒杀活性计算方法求出平行孔的平均值，按以下方法计算各组细胞毒杀活性，以杀瘤率％表示。
nk细胞杀瘤活性活性＝(1-靶细胞孔od值一效应细胞孔od值)/靶细胞孔od值×100％
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。