一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法与流程

本发明属于抗肿瘤效应细胞培养领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法。

背景技术：

肿瘤免疫治疗是通过调动宿主的天然防卫机制或给予某些生物制剂以取得抗肿瘤效应，根据作用机制分三类：主动性免疫治疗(肿瘤疫苗)、过继性治疗免疫和非特异性免疫调节剂。过继性免疫治疗通过分离自体或异体淋巴细胞，经过体外激活并回输，消除肿瘤，过继性细胞治疗的关键在于产生数量足够、能够识别肿瘤抗原的效应细胞。

1922年，maccarty提出了肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，til)的概念，在此之后肿瘤浸润淋巴细胞就持续成为了人们最为热衷关注的一类抗癌效应细胞。研究集中在肿瘤浸润淋巴细胞针对不同种类肿瘤的作用效果。对于肿瘤浸润淋巴细胞的体外增殖鲜有报道。

cn102174469a公开了一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法。从患者胸腹水或肿瘤组织中提取单个核细胞，洗涤后接种到重组人纤维蛋白和聚类分化群3抗体包被的培养瓶中，培养24小时后，加入白介素ⅱ，之后每隔2-3天用含白介素ⅱ、胸腹水上清的无血清培养基扩瓶、传代培养，第12～13天加入凋亡调节蛋白生存素和粘蛋白-1激活杀伤活性，第14天收获细胞。cn103374548a公开了一种肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增培养液，所述的培养液中含有il-2，il-12，anti-cd28和anti-ctla-4。与现有技术相比，本发明采用含il-2，il-12，anti-cd28和anti-ctla-4等细胞因子组合的无血清培养基，til细胞的扩增效率明显提高，比常用扩增培养液的扩增效率高3～10倍；并可以有效地抑制treg淋巴细胞对细胞毒性t淋巴细胞的抑制功能，扩增的淋巴细胞具有极强杀瘤效果。

技术实现要素：

本发明的发明人经过不断实验，令人惊喜的发现了肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，til)与单个核细胞(mononuclearcell，mnc)共生的生物学特性，其在肿瘤浸润淋巴细胞的高效增殖方面产生了预料不到的效应，本发明即是基于以上发现而完成。

本发明的目的在于提供高效率增殖肿瘤浸润淋巴细胞的方法，具体如下：

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:1-1:20混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁵/ml-1×10⁷/ml；

s5，培养10-20天，离心收获细胞。

优选的，所述s1步骤中的肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞的混合数目比例为1:10。

优选的，所述s2步骤中的共培养基包括til-b培养基和aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

进一步优选的，所述til-b培养基和aim-v(invitrogen)培养基的体积百分比分别为10-90％和90-10％。

更进一步优选的，所述til-b培养基和aim-v(invitrogen)培养基的体积百分比分均为50％。

优选的，还包括单个核细胞预处理步骤。

进一步优选的，所述单个核细胞预处理步骤包括以下步骤：

s01，以无血清rpmi-1640培养基作为基础培养基溶解丝裂霉素，配制丝裂霉素的终浓度为10-30ug/ml的培养基，过滤除菌，得到处理液；

s02，将数目不低于1×10⁷的脐血单个核细胞与10-15mls01步骤得到的处理液混合，37℃静置10-60min；

s03，1500rpm离心5mim去上清；

s04，洗涤：加入15-30mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5mim去上清，重复4-5次。

进一步优选的，所述s01步骤的处理液中，丝裂霉素的终浓度为20ug/ml。

更进一步优选的，所述s02步骤中，37℃静置30min。

本发明中的s2步骤的补液是指补充培养基(液体)。

本发明中的涉及的器材和试剂药品，除特别说明外，均为市售常规商品。

本发明中的比例和百分比，除特别说明外，液体为体积，固体为质量。

本发明的单个核细胞来自异体来源的脐血。

本发明的有益效果是，本发明提出了一种快速、高效增殖肿瘤浸润淋巴细胞的共培养方法，并公开了对增殖影响具有协同作用的几个影响因素。本发明的增殖肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞的共培养方法，肿瘤浸润淋巴细胞的增殖倍数显著提高，同时具有cd3阳性、cd4阴性和cd8阳性的优点。

附图说明

图1实施例10收获的肿瘤浸润淋巴细胞的流式散点图(尤文氏瘤来源)

1-1，fitc:cd4；1-2，percp:cd3；1-3，pe:cd8

图2实施例10收获的肿瘤浸润淋巴细胞的流式散点图(肺癌来源)

1-1，fitc:cd4；1-2，percp:cd3；1-3，pe:cd8

具体实施方式

为详细说明本发明之技术内容、构造特征、所达成目的及功效，以下兹例举实施例详予说明。

实施例1

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:1混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例2

一种til肿瘤浸润淋巴细胞与mnc单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取til肿瘤浸润淋巴细胞与mnc单个核细胞按数目比例1:1混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁵/ml；

s5，培养20天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例3

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:1混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁸/ml；

s5，培养10天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例4

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:20混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例5

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例6

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括90％体积百分比的til-b培养基和10％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例7

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括50％体积百分比的til-b培养基和50％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

实施例8

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括50％体积百分比的til-b培养基和50％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

还包括单个核细胞预处理步骤。

所述单个核细胞预处理步骤包括以下步骤：

s01，以无血清rpmi-1640培养基作为基础培养基溶解丝裂霉素，配制丝裂霉素的终浓度为10ug/ml的培养基，过滤除菌，得到处理液；

s02，将数目不低于1×10⁷的脐血单个核细胞与10-15mls01步骤得到的处理液混合，37℃静置60min；

s03，1500rpm离心5mim去上清；

s04，洗涤：加入15-30mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5mim去上清，重复4-5次。

实施例9

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括50％体积百分比的til-b培养基和50％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

还包括单个核细胞预处理步骤。

所述单个核细胞预处理步骤包括以下步骤：

s01，以无血清rpmi-1640培养基作为基础培养基溶解丝裂霉素，配制丝裂霉素的终浓度为30ug/ml的培养基，过滤除菌，得到处理液；

s02，将数目不低于1×10⁷的脐血单个核细胞与10-15mls01步骤得到的处理液混合，37℃静置10min；

s03，1500rpm离心5mim去上清；

s04，洗涤：加入15-30mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5mim去上清，重复4-5次。

实施例10

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括50％体积百分比的til-b培养基和50％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

还包括单个核细胞预处理步骤。

所述单个核细胞预处理步骤包括以下步骤：

s01，以无血清rpmi-1640培养基作为基础培养基溶解丝裂霉素，配制丝裂霉素的终浓度为20ug/ml的培养基，过滤除菌，得到处理液；

s02，将数目不低于1×10⁷的脐血单个核细胞与10-15mls01步骤得到的处理液混合，37℃静置30min；

s03，1500rpm离心5mim去上清；

s04，洗涤：加入15-30mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5mim去上清，重复4-5次。

对照例1

一种肿瘤浸润淋巴细胞培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基包括10％体积百分比的til-b培养基和90％体积百分比的aim-v(invitrogen)培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

对照例2

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基为til-b培养基；所述til-b培养基的基本培养基为rpmi-1640培养基，所述rpmi-1640培养基添加有以下终浓度的溶质：10％人源血清、25mmhepes、6000u/mlil-2、0.055mmβ-巯基乙醇。

对照例3

一种肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞共培养方法，包括以下步骤：

s1，取肿瘤浸润淋巴细胞与单个核细胞按数目比例1:10混合；

s2，加入共培养基，所述共培养基中至少包括til细胞培养基和mnc细胞培养基；

s3，置于37℃、co2培养箱培养；

s4，每天计数，补液，维持细胞密度1×10⁶/ml；

s5，培养15天，离心收获细胞。

所述s2步骤中的共培养基为aim-v(invitrogen)培养基。

实验例1共培养方法对肿瘤浸润淋巴细胞增殖的影响实验

采用实施例或对照例的方法对来自尤文氏瘤和肺癌的肿瘤浸润淋巴细胞，培养起始数目肿瘤浸润淋巴细胞为2×10⁶，单个核细胞按照方法中的比例。

扩增倍数为肿瘤浸润淋巴细胞的收获细胞数据/初始细胞数目。

表1共培养对肿瘤浸润淋巴细胞增殖的影响

#和*符号数目相同表示没有显著性差异，数目不同表示有显著性差异(p<0.05)

从表1可以看出，尤文氏瘤来源和肺癌来源的肿瘤浸润淋巴细胞增殖效果，实施例1-5均显著优于对照例1，说明了与单个核细胞共培养促进肿瘤浸润淋巴细胞增殖的生物学特性。实施例1-5中，实施例5较优，说明了共培养的比例也会影响增殖效果，且这种效果不是线性的。实施例5-7优于对照例2-3，说明共培养细胞需要不同于现有培养基的新培养基，培养基的组分会影响增殖效果，而且这种效果与共培养细胞的比例有协同作用。

实验例2单个核细胞预处理对肿瘤浸润淋巴细胞增殖的影响实验

与实验例1的不同之处在于共培养方法采用不同的实施例。

表2单个核细胞预处理对肿瘤浸润淋巴细胞增殖的影响

&和ξ符号数目相同表示没有显著性差异，数目不同表示有显著性差异(p<0.05)

从表2可以看出，单个核细胞预处理对尤文氏瘤来源和肺癌来源的肿瘤浸润淋巴细胞增殖效果影响很大，与没有预处理的实施例7相比较，实施例9增殖效果相当，实施例10较优，实施例8较差。

实验例3共培养所得的肿瘤浸润淋巴细胞的质量实验

对收获的细胞，用荧光和表面抗原标记，用流式细胞仪分析计数。

从图1和图2，可以看出，采用实施例10的方法，对尤文氏瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞进行增殖，收获的细胞，cd3、cd8绝大多数为阳性，cd4为阴性，质量很高，具有很好的临床应用价值。

综上所述，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。