本发明涉及细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种分离制备牙髓干细胞的方法。
背景技术：
：干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和完整个体的潜在功能。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿、脂肪、皮肤及毛囊等。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是可形成多种细胞类型的多能干细胞。具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，许多难治愈的疾病，有了新的治疗方法。牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，dpscs)属于多功能的成体干细胞，是从牙髓组织中分离出的间充质干细胞。现在牙髓干细胞已经被证实具有多向分化能力，能够分化为骨、脂肪和血管内皮等组织细胞。现已有研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体、牙冠的组织修复与再生，还可以用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复。牙髓干细胞在其他疾病方面的研究应用也有很多，例如：牙髓干细胞可以用于治疗脑血管意外损伤、脊髓损伤、帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性等疾病。牙髓干细胞的增殖力强、组织相容性高、储存方便，给了现代人第2次储存干细胞的机会。目前牙髓干细胞制备方法常用的有酶联合消化法、组织块培养法和组织块酶消化法等方法，各种方法虽均能获得牙髓干细胞，但由于口腔中细菌种类繁杂，牙髓干细胞在制备及培养过程中极易污染，且分离提取出来的牙髓干细胞数量较少，细胞生长缓慢，导致牙髓干细胞制备困难，这也是目前存储牙髓干细胞遇到的最大难题。因此，在制备牙髓干细胞时通常选择加入抗生素以抑制细菌繁殖，在干细胞培养中常用的抗生素种类有：抑制细菌常用青霉素和链霉素，抑制真菌常用两性霉素和制霉菌素，抑制支原体污染常用庆大霉素、四环素及红霉素对等。但是以上抗生素的应用并不能确保牙髓干细胞不被污染。氯化两面针碱(nitidinechloride)是由芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取的一种有效生物碱，两面针：性辛、苦、微温，有小毒，归肝、肾经，用于治疗胃痛、牙痛、神经痛、风湿骨痛、毒蛇咬伤等多种病症。氯化两面针碱是两面针的主要有效成分，是两面针及其制剂的主要质量控制指标成分，近年来研究发现氯化两面针碱高效低毒，具有抗肿瘤、强心、降血压、抗真菌等药理作用。透明质酸是一种酸性粘多糖，与其盐类是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节软骨、关节滑液等结缔组织的主要成分。透明质酸在人体的生理活动中发挥着至关重要的作用，如果关节腔、血管、心脏、眼、脑等组织器官中的透明质酸含量下降，可能会导致关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等疾病。透明质酸是一种分布在多种组织细胞外基质中的蛋白多糖，具有良好生物相容性，并在生物发育和机体损伤修复过程中发挥重要作用，其已成为一种有前景的医药生物材料，在三维细胞培养、组织工程支架以及再生医学领域得到广泛的应用。明胶(gelatin)是一种高分子量的水溶性蛋白混合物，主要存在于胶原中。通过煮沸皮肤、筋腱、韧带、骨头等获得。a型明胶通过酸水解组织获得，而b型明胶通过石灰水解组织获得。明胶在食物中可以用作稳定剂和增稠剂，在细菌学和细胞培养中可抑制结晶，也可用于杂交反应等。质量好的明胶蛋白质含量高、颜色为白色，完全溶于水，水溶解后无异味，是无毒无刺激性原料，已收载于fda《非活性组分指南》，适用于牙用制剂、吸入制剂、注射剂、口服胶囊、锭剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、外用制剂和阴道制剂，是英国准许用于医药品中的一种原料之一。牙髓干细胞在制备过程中不仅极易污染，导致细胞数量较少，生长缓慢。并且，还常因为牙髓间充质干细胞不易贴壁造成细胞损失。但是，目前尚未有报道称通过怎样的手段能够解决这些问题，因此，进一步提高牙髓干细胞分离培养的效率，仍是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种分离制备牙髓干细胞的方法，本发明提供的方法污染率低，贴壁时间短，获得细胞的数量多。本发明提供了氯化两面针碱在牙髓间充质干细胞分离制备中的应用。现有技术研究表明，氯化两面针碱有抗肿瘤、强心、降血压、抗真菌等药理作用。本发明研究表明，其能够对牙齿或牙髓组织消毒，避免细菌、真菌或支原体感染，从而提高了培养细胞的获得率。本发明提供了一种牙髓间充质干细胞培养液，其由胎牛血清、转铁蛋白、双抗、氯化两面针碱和dmem/f12培养基组成。本发明实施例中，牙髓间充质干细胞培养液由15％v/v胎牛血清、1～150μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5～10μg/ml氯化两面针碱。一些具体实施例中，牙髓间充质干细胞培养液由15％v/v胎牛血清、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5μg/ml氯化两面针碱。本发明还提供了一种牙髓组织消毒剂，为含有0.5～10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。一些实施例中，牙髓组织消毒剂为含有0.5μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。一些实施例中，牙髓组织消毒剂为含有5.0μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。一些实施例中，牙髓组织消毒剂为含有10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。本发明还提供了一种牙齿运输液，为含有双抗和0.5～10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。本发明还提供了一种牙齿运输液为含有双抗和0.5μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。本发明还提供了一种牙齿运输液为含有双抗和5.0μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。本发明还提供了一种牙齿运输液为含有双抗和10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水。本发明中，所述双抗为青霉素和链霉素，所述青霉素在培养液或运输液中的终浓度为1000～2000u/ml；所述链霉素在培养液或运输液中的终浓度为1000～2000μg/ml。一些具体实施例中，所述青霉素在培养液或运输液中的终浓度为1000u/ml；所述链霉素在培养液或运输液中的终浓度为1000μg/ml。本发明中，所述dmem/f12培养基为dmem液体培养基和f12液体培养基的混合物，其中，dmem培养基与f12培养基的体积比为1：1。采用本发明提供的运输液对牙齿进行运输和消毒，采用本发明提供的牙髓组织消毒剂对牙髓组织进行清洗消毒，然后采用本发明提供的牙髓间充质干细胞培养液进行牙髓间充质干细胞的分离与培养，能够降低细胞的污染风险，避免细胞被细菌、真菌或支原体感染，从而提高细胞的收获量。本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的分离制备方法，将牙髓组织清洗消毒后进行消化，所得细胞本发明提供的牙髓间充质干细胞培养液重悬，接种于经透明质酸和明胶包被的培养器皿中，原代培养；所述清洗消毒包括5步，依次采用含0.5～10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水、体积分数为70％～75％的乙醇、生理盐水、含有双抗的pbs缓冲液、pbs缓冲液。本发明中，所述牙髓组织来源于智齿，智齿的杀菌和运输采用含有双抗和0.5～10μg/ml氯化两面针碱的生理盐水作为运输液。所述运输液中，含有1000～2000u/ml青霉素，1000～2000μg/ml链霉素和0.5～10μg/ml氯化两面针碱。一些具体实施例中，所述运输液中含有1000u/ml青霉素，1000μg/ml链霉素和0.5μg/ml氯化两面针碱。一些具体实施例中，所述运输液中含有1000u/ml青霉素，1000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱。一些具体实施例中，所述运输液中含有1000u/ml青霉素，1000μg/ml链霉素和10μg/ml氯化两面针碱。本发明中，消化采用i型胶原蛋白酶和ii型胶原蛋白酶。消化液中，i型胶原蛋白酶的质量分数为0.05％～0.3％，ii型胶原蛋白酶的质量分数为0.05％～0.3％。所述消化液的体积是牙髓组织的5～10倍。所述消化的条件为37℃，200r/min的振荡30min～40min。以含15％fbs的dmem/f12培养基终止消化。消化后经1200r/min离心10min后，收集沉淀即为待培养的细胞，以本发明提供的牙髓间充质干细胞培养液重悬。所述包被的透明质酸和明胶的质量比为(4～5)：(2～3)。包被液中，透明质酸的质量分数为2.5％～10％；明胶的质量分数为1％～7.5％。一些实施例中，包被液中透明质酸的质量分数为2.5％；明胶的质量分数为1％％。一些实施例中，包被液中透明质酸的质量分数为5％；明胶的质量分数为3％。一些实施例中，包被液中透明质酸的质量分数为10％；明胶的质量分数为7.5％。本发明中，所述包被的量为20～30μl/cm2。本发明中，原代培养的条件为置于37℃，5％co2恒温培养箱中进行培养。本发明中，所述原代培养后还包括传代的步骤。本发明在牙髓干细胞制备过程中使用天然化合物氯化两面针碱作为抑菌剂，安全性高、稳定性好、抑菌效果明显，能够有效地减少细菌、真菌或支原体的感染，优越于以往的单纯用抗生素的方法。并且本发明在培养过程中，用透明质酸与明胶包被培养皿，增加了牙髓干细胞贴壁数量，并且促进细胞生长，从而达到有效扩增的目的。实验表明，采用本发明提供的方法对牙髓间充质干细胞进行扩增获得的细胞量大。污染率低，且获得的牙髓干细胞表面标志物检测都符合标准，阳性表达的表面标志物≥95％，阴性表达的表面标志物≤2％。具体实施方式本发明提供了一种分离制备牙髓干细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1使用0.5μg/ml氯化两面针碱处理的牙髓干细胞的分离制备1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和0.5μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将10％w/v透明质酸与6％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织，并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入事先用10％w/v透明质酸与6％w/v明胶包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例2使用5μg/ml氯化两面针碱处理的牙髓干细胞的分离制备1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有5.0μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将10％w/v透明质酸与6％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入事先用10％w/v透明质酸与6％w/v明胶包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例3使用10μg/ml氯化两面针碱处理的牙髓干细胞的分离制备1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和10μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有10μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将10％w/v透明质酸与6％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入事先用10％w/v透明质酸与6％w/v明胶包被的细胞培养器皿中进行原代培养。对比例1不使用氯化两面针碱处理的牙髓干细胞的分离制备1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和不含有氯化两面针碱的运输液中运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗。4)培养器皿包被：将10％w/v透明质酸与6％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入事先用10％w/v透明质酸与6％w/v明胶包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例4使用氯化两面针碱处理与不使用其处理的牙髓干细胞污染率的比较将分别使用不同浓度氯化两面针碱处理牙髓干细胞的实施例1-3与不使用氯化两面针碱处理的对比例1培养的牙髓干细胞每三天换一次液，将换掉的细胞废液注入到细菌培养瓶中，进行培养观察，观察细胞是否发生污染。结果见表1。表1：牙髓干细胞的污染状况统计表表1结果显示，使用三种含有不同浓度的氯化两面针碱运输液及缓冲液处理的细胞各6例，共计18例，其中用0.5μg/ml氯化两面针碱运输液及缓冲液处理的细胞发生污染的为1例，为支原体污染，而用5μg/ml及10μg/ml氯化两面针碱处理的细胞则未发生污染，使用三种含有不同浓度的氯化两面针碱运输液及缓冲液处理的细胞总污染概率为5.6％；而使用不含有氯化两面针碱的运输液及缓冲液处理的细胞共6例，经培养后5例发生污染，污染率为83％，其中有2例细菌污染，1例真菌污染，2例支原体污染，说明不同浓度的氯化两面针碱在牙髓干细胞制备过程中均具有抗污染的作用，并且效果明显，而且具有剂量依赖效应。表2：牙髓干细胞的生长状况统计表表2结果显示，使用三种含有不同浓度的氯化两面针碱处理的细胞其贴壁时间分别为1.5h、1.75h和2.5h；而未使用氯化两面针碱处理的细胞其贴壁时间为2.5h。使用三种含有不同浓度的氯化两面针碱处理的细胞其融合度达到80％-90％的时间分别为5天、5天和6.5天；而未使用氯化两面针碱处理的细胞其融合度达到80％-90％的时间为7天。此结果表明，使用氯化两面针碱处理并未抑制细胞的贴壁时间和增殖速度，反而对增殖有一定的促进作用。实施例5用5％w/v透明质酸与2％w/v明胶包被培养皿的牙髓干细胞制备方法1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有5.0μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、1％v/v双抗、50μg/ml转铁蛋白、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将5％w/v透明质酸与2％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2的量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入已包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例6用10％w/v透明质酸与6％w/v明胶包被培养皿的牙髓干细胞制备方法1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有5.0μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、1％v/v双抗、50μg/ml转铁蛋白、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将10％w/v透明质酸与6％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入已包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例7用20％w/v透明质酸与15％w/v明胶包被培养皿的牙髓干细胞制备方法1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有5.0μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、1％v/v双抗、50μg/ml转铁蛋白、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)培养器皿包被：将20％w/v透明质酸与15％w/v明胶等体积混合，再以20μl/cm2的量包被于细胞培养器皿中，形成凝胶涂层，成为牙髓干细胞专用培养皿。5)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入已包被的细胞培养器皿中进行原代培养。对比例2不包被培养皿的牙髓干细胞制备方法1)牙齿的采集：针对脱落乳牙的少年、儿童或者牙齿需要整形矫正而需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，常规处理后，保存于含有1000-2000u/ml青霉素，1000-2000μg/ml链霉素和5.0μg/ml氯化两面针碱的运输液中，4℃冷藏，运输至实验室，并在24小时内进行分离处理。2)牙髓清洗消毒：将采集的牙齿转移至洁净无菌平皿中，使用无菌医眼科镊进行夹取，依次用含有5.0μg/ml氯化两面针碱的0.9％生理盐水，75％医用酒精，0.9％生理盐水，含有1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素的pbs缓冲液，pbs缓冲液进行牙齿的清洗消毒。3)牙髓干细胞专用培养基配制：将dmem与f12培养基等比例混合，加入15％v/vfbs、50μg/ml转铁蛋白、1％v/v双抗、0.5μg/ml氯化两面针碱。4)牙髓干细胞分离：a)在无菌条件下将清洗后的牙齿在生物安全柜中分离出牙髓组织并用含有0.5μg/ml氯化两面针碱的pbs缓冲液充分冲洗；b)使用医用眼科剪将挑选出的牙髓组织剪碎，加入5-10倍体积的胶原蛋白酶混合液(0.5％i型胶原蛋白酶与0.5％ii型胶原蛋白酶等比例混合)作为消化液，轻轻摇匀，置于37℃，200r/min的恒温振荡培养器中振荡培养30min；c)消化完成后，在悬液中加入含15％胎牛血清的dmem与f12混合培养基终止消化，在1200r/min离心10min，弃上清；d)用10倍体积的牙髓干细胞培养专用培养基重悬细胞，转入未包被的细胞培养器皿中进行原代培养。实施例8平皿包被与不包被情况下牙髓干细胞的生长状况比较将实施例5～7与对比例2培养的牙髓干细胞进行传代培养，每三天换一次细胞培养基，观察牙髓干细胞贴壁的时间、细胞形态，细胞融合度达到80％-90％的时间。结果见表3。表3：牙髓干细胞的生长状况统计表结果显示，在含有透明质酸与gelatin包被的细胞培养皿中培养的牙髓干细胞在培养到p2代时，细胞的贴壁时间更快，细胞达到80-90％融合度的时间也比较快，细胞长势良好。实施例9msc的鉴定将实施例1-3、5-7与对比例1、2的牙髓干细胞培养至对数期(p2代)时，进行msc鉴定。1)细胞表面标志检测：a)取生长状态良好且细胞密度达到80％-90％的细胞制成细胞悬液，使用细胞计数仪计数后，4℃，400×g离心5min，小心的吸去上清；b)根据细胞计数的结果，加入pbs缓冲液重悬配制为细胞悬液，使其细胞密度为0.5×107个/ml；c)将细胞悬液以100μl/管的体积分装至已加抗体的ep管，并吹打混匀；d)将加完抗体的样品置于避光处，常温孵育20-30min；e)孵育后，4℃，400×g离心5min，小心的吸去含抗体的上清液，加500μl的pbs重悬，流式细胞仪上样检测。2)细胞分化鉴定：a)取生长状态良好的细胞，消化收集，在6孔板中进行培养；b)每个实验样本每个项目做两孔，一个空白对照孔；c)待细胞达到80％-100％融合，成骨培养孔更换为1ml的hmsc成骨诱导培养基，脂肪培养孔更换为1ml脂肪细胞诱导培养基，软骨培养孔更换为软骨诱导培养基，对照组分别加入1ml完全培养基，继续培养，每3-4天更换一次相同培养基；d)保持诱导条件，持续培养2-3周；e)培养结束后，成骨培养孔使用pbs清洗细胞，95％乙醇固定10分钟，纯水清洗2次，茜素红染色30min，水清洗2次，显微镜下观察拍照；f)脂肪培养孔使用pbs清洗细胞，适量多聚甲醛固定10min，纯水清洗2次，油红o染色1小时，纯水清洗2次，显微镜下观察拍照；g)软骨培养孔，pbs清洗，适量多聚甲醛固定10分钟，纯水清洗2次，甲苯胺蓝染色5分钟，纯水清洗2次，显微镜下观察拍照。msc鉴定结果将用不同浓度氯化两面针碱处理干细胞的实施例1-3与未用氯化两面针碱处理的对比例1进行牙髓干细胞表面标志及分化潜能比较；将用不同浓度明胶和透明质酸包被平皿的实施例5-7与未用明胶和透明质酸的对比例2进行牙髓干细胞表面标志及分化潜能比较。取生长状态良好且细胞密度达到80％-90％的细胞制成细胞悬液，使用流式细胞术对细胞表面标志物进行检测，检测结果统计见表4。表4：细胞表面标志物检测结果统计表标志物名称实施例1实施例2实施例3实施例5实施例6实施例7对比例1对比例2cd34+0.28％0.32％0.39％0.51％0.32％0.03％1.45％0.83％cd45+0.28％0.32％0.39％0.51％0.32％0.03％1.45％0.83％cd14+0.28％0.32％0.39％0.51％0.32％0.03％1.45％0.83％cd19+0.28％0.32％0.39％0.51％0.32％0.03％1.45％0.83％hla-dr+0.28％0.32％0.39％0.51％0.32％0.03％1.45％0.83％cd90+99.93％99.94％99.96％99.87％99.94％99.99％97.12％99.88％cd73+99.98％99.99％99.97％99.99％99.99％100.00％98.34％99.90％cd105+99.97％98.54％99.50％97.47％99.54％99.65％95.23％99.21％对每例生长状态良好的细胞进行细胞分化鉴定，观察其是否可以在不同诱导培养基的培养下，分化成不同的细胞。其分化结果统计见表5。表5：细胞分化鉴定结果统计表结果显示，使用含有氯化两面针碱运输液及缓冲液处理牙髓干细胞和使用普通运输液及缓冲液处理的牙髓干细胞表面标志物检测都符合标准，阳性表达的表面标志物≥95％，阴性表达的表面标志物≤2％，但是由于没有加入氯化两面针碱的细胞发生污染，对细胞纯度有一定的影响，因此不应该表达的阴性标志物含量比较多。从表4来看，实施例6～7方案获得的细胞的质量显著优于其他实施例或对比例，阴性表达的表面标志物的表达量显著低于其他实施例或对比例，p<0.05。以上结果说明，氯化两面针碱处理后并未影响细胞的牙髓干细胞特性，也未影响其分化潜能。将牙髓干细胞接种到经过明胶和透明质酸包被的细胞培养皿中及未进行明胶和透明质酸包被的细胞培养皿中进行培养，发现这两种方式培养的细胞表面标志物均合格，并且结果都比较理想，只有在不应该表达的细胞表面标志物含量有细微差别，说明在加入明胶和透明质酸的细胞培养皿内培养的牙髓干细胞纯度比较高，不表达的表面标志物含量较少，更有利于牙髓干细胞的生长。在细胞生长状态良好时，牙髓干细胞都可以在相应的诱导培养基培养下，分化为其他的细胞，但是由于对比例1细胞发生污染，影响细胞生长状态，因此影响其分化能力。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12