一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用。
背景技术：
：半纤维素是植物细胞壁中含量第二高的成分，是自然界中含量第二多的多糖类物质。木聚糖是半纤维素中最重要的组成成分，占被子植物细胞干重的15-30％左右，然而半纤维素或木聚糖难于降解，完全降解木聚糖需要多步酶促反应和多种水解酶的协同作用，其中β-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase,e.c.3.2.1.8)和β-木糖苷酶是最关键的水解酶。木聚糖酶可以打开木聚糖的木糖苷键，有效地降解高聚木聚糖成为木糖单体或低聚木聚糖。在造纸上，纸浆经木聚糖酶处理可以有效释放木质素，从而使色素从纤维素中分离出来达到漂白效果。在饲料中含有的木聚糖是一种抗营养因子，其本身不会被动物消化吸收并且会使饲料粘度增加不利于动物消化，利用木聚糖酶降解饲料中的木聚糖可以加大饲料的吸收率。不论是造纸业还是畜牧业对木聚糖酶的使用中，都会有需要高温处理的过程，野生型木聚糖酶在高温处理后活性丧失较大，这加大了其工业使用的成本，所以工业产业中急需一种耐热的木聚糖酶。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为xylanase-m，又称xylanase-m蛋白，为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列1中第11-235位氨基酸残基组成的蛋白质；(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；(a3)在(a1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。所述标签见表1。表1标签的序列编码xylanase-m蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的dna分子：(b1)编码区如序列表的序列2第31-705位核苷酸所示的dna分子；(b2)编码区如序列表的序列2所示的dna分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；(b4)与(b1)或(b2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为以载体pet-28a(+)为出发载体得到的重组质粒。所述重组载体具体可为在载体pet-28a(+)的ncoi和ecori酶切位点之间插入序列表的序列2第5-708位核苷酸所示的双链dna分子得到的重组质粒。所述重组菌可为将重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌，具体可为将重组载体导入大肠杆菌bl21(de3)得到的重组菌。本发明还保护xylanase-m蛋白作为木聚糖酶的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的ph可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。本发明还保护xylanase-m蛋白在降解木聚糖中的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的ph可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。本发明还保护xylanase-m蛋白在以木聚糖为底物生产还原糖中的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的ph可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。本发明还保护一种试剂盒，包括xylanase-m蛋白；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)：(c1)降解木聚糖；(c2)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。本发明还保护一种试剂盒，包括所述基因；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)生产木聚糖酶；(d2)降解木聚糖；(d3)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。本发明还保护一种试剂盒，包括含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)生产木聚糖酶；(d2)降解木聚糖；(d3)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。本发明在现有木聚糖酶的基础上构建了突变蛋白库，经过大量筛选验证，获得了一个突变体蛋白，其热稳定性大幅度提高，从而在工业生产中的实用性大大提高。本发明可用于食品产业、动物饲料产业以及造纸漂白工业等，具有重大的应用价值。附图说明图1为实施例4的步骤一的结果。图2为实施例4的步骤二的结果。图3为实施例4的步骤三的结果。图4为实施例4的步骤四的结果。图5为实施例4的步骤五的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pet-28a(+)：invitrogen公司。大肠杆菌bl21(de3)：大肠杆菌bl21(de3)。桦木木聚糖：sigma，产品编号x0502，cas号9014-63-5。荧光染料：thermofisher，货号s6651。野生型木聚糖酶(xylanase-wt)由序列表的序列3第11-235位氨基酸残基组成，其编码基因如序列表的序列4第31-705位核苷酸所示。木聚糖酶突变体(xylanase-m)由序列表的序列1第11-235位氨基酸残基组成，其编码基因如序列表的序列2第31-705位核苷酸所示。实施例1、重组菌的构建将序列表的序列4第5-708位核苷酸所示的双链dna分子插入载体pet-28a(+)的ncoi和ecori酶切位点之间，得到重组质粒pet28a-xylanase-wt。经测序，对重组质粒pet28a-xylanase-wt进行结构描述如下：外源dna分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的蛋白质。序列表的序列3中，第5-10位氨基酸氨基组成his6标签，第11-235位氨基酸残基组成野生型木聚糖酶。将重组质粒pet28a-xylanase-wt导入大肠杆菌bl21(de3)，获得重组菌，将其命名为重组菌bl21/xylanase-wt。将序列表的序列2第5-708位核苷酸所示的双链dna分子插入载体pet-28a(+)的ncoi和ecori酶切位点之间，得到重组质粒pet28a-xylanase-m。经测序，对重组质粒pet28a-xylanase-m进行结构描述如下：外源dna分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列1中，第5-10位氨基酸氨基组成his6标签，第11-235位氨基酸残基组成木聚糖酶突变体。将重组质粒pet28a-xylanase-m导入大肠杆菌bl21(de3)，获得重组菌，将其命名为重组菌bl21/xylanase-m。实施例2、木聚糖酶的制备试验菌分别为：重组菌bl21/xylanase-wt或重组菌bl21/xylanase-m。1、将试验菌接种至液体lb培养基中，37℃、250rpm振荡培养至od600nm值为1。2、完成步骤1后，在体系中加入iptg并使其浓度为0.1mm，30℃、200rpm振荡培养16h。3、完成步骤2后，离心收集菌体，用ph7.0、50mm的pbs缓冲液重悬后进行超声破碎(超声破碎参数：功率30％，总时间20min，每工作5s停5s)，然后12000rpm离心10min，收集上清液。4、取步骤3得到的上清液，进行镍柱亲和层析。镍柱(柱体积为2ml)：6ffnisepharose(北京江晨源远生物技术有限公司；货号：ha-0710-02)。洗涤液：含有25mm咪唑的ph8.0、20mmtris-hcl缓冲液。洗脱液：含有250mm咪唑的ph8.0、20mmtris-hcl缓冲液。步骤：先用ph8.0、20mmtris-hcl缓冲液平衡柱子；然后上样15ml步骤3得到的上清液；然后用10ml洗涤液洗涤柱子；然后用10ml洗脱液洗脱柱子并收集过柱后溶液。5、取步骤4得到的过柱后溶液，用3kd孔径的柱式超滤膜进行脱盐。步骤：先用ph7.0、50mm的pbs缓冲液平衡超滤膜；然后上样步骤4得到的过柱后溶液；然后用ph7.0、50mm的pbs缓冲液反复洗涤除盐，得到以ph7.0、50mm的pbs缓冲液为溶剂体系的蛋白溶液。试验菌为重组菌bl21/xylanase-wt，得到的蛋白溶液命名为xylanase-wt溶液。试验菌为重组菌bl21/xylanase-m，得到的蛋白溶液命名为xylanase-m溶液。实施例3、木聚糖酶的活性分析(dns法)1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。一、制备待测溶液。取实施例2制备的xylanase-wt溶液或xylanase-m溶液，用ph7.0、50mm的pbs缓冲液稀释后作为待测溶液。二、检测待测溶液的蛋白浓度。检测步骤1制备的待测溶液中目的蛋白的浓度(以总蛋白浓度计)。三、检测待测溶液的酶活。1、制备初始反应体系。初始反应体系(100μl)由待测溶液、桦木木聚糖和ph7.0、50mm的pbs缓冲液组成。初始反应体系中，蛋白的浓度为0.005mg/ml，桦木木聚糖的浓度为1g/100ml。2、将步骤1制备的初始反应体系37℃/60℃静置反应10min，然后加入100μldns溶液终止反应，然后沸水煮10min。dns溶液的制备方法：称取3，5-二硝基水杨酸(10土0.1)g，置于约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤；贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。3、完成步骤2后，反应体系冷却至室温，用超纯水稀释后于540nm测定od值，将od值通过标准曲线转换为μmol数。每次试验需要重新制作做标准曲线，某次标注曲线方程为：y＝(x-0.39)×n1÷5.10。y代表酶解释放的还原糖量，单位为μmol；x代表测得的od值；n1代表稀释倍数。4、计算蛋白的比活力。比活力＝还原糖量÷(10×反应体系中的蛋白量)。比活力的单位为u/mg，还原糖量的单位为μmol，蛋白量的单位为mg。结果见表2。37℃下，xylanase-wt和xylanase-m的比活力在基本一致。60℃下，xylanase-m的比活力极其显著的高于xylanase-wt。表237℃60℃xylanase-wt5700u/mg8300/mgxylanase-m5500u/mg11200/mg实施例4、木聚糖酶的部分性质分析待测蛋白溶液为实施例2制备的xylanase-wt溶液或xylanase-m溶液。一、热稳定性测定(tm值)蛋白质溶液在逐渐加热到临界温度以上时，蛋白质的构象从天然状态到变性状态有一个显著的转变，这个转变的中点温度称为熔化温度(tm)。取待测蛋白溶液，加入荧光染料和ph7.0、50mm的pbs缓冲液，得到蛋白浓度为0.05mg/ml、荧光染料浓度为0.2％的待测溶液。取待测溶液，检测熔化温度。结果见图1。xylanase-m的tm值为70.5℃，xylanase-wt的tm值为55℃。二、热稳定性取待测蛋白溶液，用ph7.0、50mm的pbs缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/ml，然后65℃静置孵育。分别于65℃静置孵育前、65℃静置孵育0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时或6小时后，取样10μl作为待测溶液。酶活检测方法同实施例3。将65℃静置孵育前的比活力作为100％，计算65℃静置孵育不同时间的待测酶液的相对酶活。结果见图2。xylanase-m在65℃的热稳定性非常高,65℃孵育6小时后相对酶活保持100％。xylanase-wt在65℃的热稳定性很低，65℃孵育0.5小时后，相对酶活仅为36％。结果表明,xylanase-m能够抵御高温处理，在工业生产中具有巨大的应用潜力。三、最适温度取待测蛋白溶液，用ph7.0、50mm的pbs缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/ml，作为待测溶液。酶活检测方法参见实施例3。反应温度分别设置为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃，其他同实施例3。将最高比活力作为100％，计算其他反应温度下的相对酶活。结果见图3。xylanase-wt的最适温度为55℃。xylanase-m的最适温度为65℃,并且在75℃时的相对酶活仍然能够维持在50％左右。四、ph稳定性取待测蛋白溶液，用缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/ml，然后37℃静置孵育1h，得到待测溶液。缓冲液分别为：ph3.0-7.5的100mm柠檬酸钠缓冲液，ph8.0-9.0的100mm的tris-hcl缓冲液，ph9.5-10.0的100mm的gly-naoh缓冲液。酶活检测方法同实施例3。将最高比活力作为100％，计算其他ph条件下孵育1小时后的相对酶活。结果见图4。xylanase-wt和xylanase-m的ph稳定性曲线基本一致，在碱性条件下xylanase-m比xylanase-wt更加稳定。五、最适ph取待测蛋白溶液，用ph7.0、50mm的pbs缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/ml，得到待测溶液。酶活检测方法参见实施例3。酶活检测中采用的缓冲液分别为：ph3.0-7.5的100mm柠檬酸钠缓冲液，ph8.0-9.0的100mm的tris-hcl缓冲液，ph9.5-10.0的100mm的gly-naoh缓冲液。其他同实施例3。将最高比活力作为100％，计算其他ph下的相对酶活。结果见图5。xylanase-wt和xylanase-m的最适ph曲线几乎一致，最适ph值都为5。sequencelisting<110>中国科学院微生物研究所<120>一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用<130>gncyx171492<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>235<212>prt<213>artificialsequence<400>1metglyserserhishishishishishisglnserphecysserthr151015alaserhisserglyglnservallysvalthrglyasnlysvalgly202530thrileglyglyvalglytyrgluleutrpalaaspserglyasntyr354045seralathrphetyrseraspglyserphesercysthrtrpglnasn505560alatyrasptyrleucysargserglyleuserpheaspserthrlys65707580thrproserglnileglyargmetlysalaaspphelysleuvallys859095glnasnserserasnvalglytyrsertyrvalglyvaltyrglytrp100105110thrargserproleuvalglutyrtyrilevalaspasntrpleuser115120125propheproproglyasptrpvalglyasnlyslyshisglyserphe130135140thrileaspglyalaglntyrthrvaltyrgluasnthrargthrgly145150155160proserileaspglyaspthrthrpheasnglntyrpheserilearg165170175glnglnalaargaspcysglythrileaspileseralahispheasp180185190glntrpglulysleuglymetthrmetglylysleuhisglualalys195200205valleuleuglualaglyasnvalasnglyglyalaserglythrala210215220asppheprotyralalysvaltyrileglyasp225230235<210>2<211>708<212>dna<213>artificialsequence<400>2atgggcagcagccatcatcatcatcatcaccagtctttctgtagcactgcttctcatagc60ggccagagcgtgaaagtgacgggtaacaaagtaggtactattggtggcgttggctacgag120ttgtgggcggactccggcaactattccgcaaccttctactctgatggtagcttctcttgc180acttggcaaaacgcgtatgactatctgtgccgctctggcctgtctttcgattctaccaaa240accccaagccaaatcggccgtatgaaagctgatttcaaactggttaaacagaactcctct300aacgtcggatactcatacgtgggtgtctacggctggacccgttcgccgctggttgagtac360tatatcgtcgacaactggctgtccccgttccctccgggtgactgggtgggtaacaagaaa420cacgggagcttcaccatcgacggtgctcagtacactgtgtatgaaaacacgcgcaccggt480ccgtccattgatggtgacactactttcaaccagtactttagcattcgtcaacaggcacgt540gattgtggcacgatcgacatctctgcgcatttcgaccagtgggaaaaactgggcatgact600atgggtaaactgcacgaggcgaaagtgctgctagaagcgggtaacgttaacggcggtgcc660tccggcaccgcagacttcccgtacgcgaaggtgtatatcggcgattaa708<210>3<211>235<212>prt<213>artificialsequence<400>3metglyserserhishishishishishisglnserphecysserser151015alaserhisserglyglnservallysvalthrglyasnlysvalgly202530thrileglyglyvalglytyrgluleutrpalaaspserglyasnasn354045seralathrphetyrseraspglyserphesercysthrpheglnasn505560alaglyasptyrleucysargserglyleuserpheaspserthrlys65707580thrproserglnileglyargmetlysalaaspphelysleuvallys859095glnasnserserasnvalglytyrsertyrvalglyvaltyrglytrp100105110thrargserproleuvalglutyrtyrilevalaspasntrpleuser115120125propheproproglyasptrpvalglyasnlyslyshisglyserphe130135140thrileaspglyalaglntyrthrvaltyrgluasnthrargthrgly145150155160proserileaspglyaspthrthrpheasnglntyrpheserilearg165170175glnglnalaargaspcysglythrileaspileseralahispheasp180185190glntrpglulysleuglymetthrmetglylysleuhisglualalys195200205valleuglyglualaglyasnvalasnglyglyalaserglythrala210215220asppheprotyralalysvaltyrileglyasp225230235<210>4<211>708<212>dna<213>artificialsequence<400>4atgggcagcagccatcatcatcatcatcaccagtctttctgtagcagtgcttctcatagc60ggccagagcgtgaaagtgacgggtaacaaagtaggtactattggtggcgttggctacgag120ttgtgggcggactccggcaacaactccgcaaccttctactctgatggtagcttctcttgc180actttccaaaacgcgggtgactatctgtgccgctctggcctgtctttcgattctaccaaa240accccaagccaaatcggccgtatgaaagctgatttcaaactggttaaacagaactcctct300aacgtcggatactcatacgtgggtgtctacggctggacccgttcgccgctggttgagtac360tatatcgtcgacaactggctgtccccgttccctccgggtgactgggtgggtaacaagaaa420cacgggagcttcaccatcgacggtgctcagtacactgtgtatgaaaacacgcgcaccggt480ccgtccattgatggtgacactactttcaaccagtactttagcattcgtcaacaggcacgt540gattgtggcacgatcgacatctctgcgcatttcgaccagtgggaaaaactgggcatgact600atgggtaaactgcacgaggcgaaagtgctgggtgaagcgggtaacgttaacggcggtgcc660tccggcaccgcagacttcccgtacgcgaaggtgtatatcggcgattaa708当前第1页12