解淀粉芽孢杆菌Rdx5及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌rdx5及其应用。

背景技术：

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，全世界超过50％的人口以大米作为主要粮食。近年来随着生活水平的提高，大米的消耗量与需求越来越大，对水稻的产量与质量要求也越来越高。相关研究表示，到2030年时水稻要增产40%才能满足人类对大米的需求。科研工作者们都在致力于高产、抗病水稻品种的研发，但水稻的生产还是受到各种生物与非生物的胁迫，使得产量低于预期，其中就包括稻瘟病菌等引起的水稻病害，使水稻减产严重。稻瘟病是水稻三大病害之一，目前的防治方法主要是抗病品种的选育与化学防治为主，化学防治效果好速度快方便又经济，已经成为现今最主要的防治措施，但是化学防治容易使稻瘟病菌产生抗药性且污染土壤环境，产生农药残留。所以我们积极的寻找新的防治手段，生物防治及生物农药的研发就变得越来越重要，植物源、微生物源的生物农药具有显著的生物防治特征，与化学防治相比，显得更加的平和，对环境的压力较小，同时由于天然产物的进化关系，抗生素、植物源农药种类繁多，靶点各异，效用因子众多，能够有效减弱稻瘟病菌抗药性对试剂的耐受效果，同时延长产品的使用时间因此，生物农药在未来将会受到更多的重视。因此探索发现能够良好防治稻瘟病，自然环境中可以降解且对人体无害的新的抗菌物质，显得非常的重要与迫切。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种解淀粉芽孢杆菌rdx5，该菌株在landy培养基，28-30℃培养产生的次生代谢产物对水稻稻瘟病具有强烈的拮抗作用。为水稻稻瘟病的防治提供新的菌株。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

菌株rdx5，分类命名为解淀粉芽孢杆菌，拉丁文学名为bacillusamyloliquefaciens，于2017年7月15日保存于中国典型培养物保藏中心（cctcc），其保存编号为cctccno:m2017406，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心。

所述解淀粉芽孢杆菌rdx5从中药材白芷中分离得到，该菌株在landy培养基，28-30℃培养产生的次生代谢产物对水稻稻瘟病具有强烈的拮抗作用。

经检验分析，所述次级代谢产物中含有抑制稻瘟病病菌的活性物质，所述活性物质包括有蛋白酶、过氧化物酶、明胶酶、纤维素酶等。这些活性物质通过破坏真菌细胞壁结构造成真菌死亡从而防治水稻稻瘟病。

所述菌株rdx5生长特性：所述解淀粉芽孢杆菌rdx5在pda培养基上生长，有褶皱，菌落圆形，边缘整齐。革兰氏染色后显微镜观察结果：革兰氏阳性菌

所述菌株rdx5生理生化特性：

所述解淀粉芽孢杆菌rdx5生理生化特征如下表1所示：

表1：

表2：

注：“+”为阳性，“-”为阴性,nd表示未测定。

菌株rdx5的鉴定：通过生理生化鉴定获得菌株rdx5的生理生化特征，从上表可见：菌株rdx5芽孢椭圆，3℃不生长，不能利用柠檬酸盐，硝酸盐还原为阳性，氧化酶/吲哚试验/卵黄磷脂酶都为阴性,能水解淀粉，并能利用多种糖醇产酸。参照《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》、东秀珠版《常见细菌系统鉴定手册》的内容，菌株rdx5的生理生化与解淀粉芽孢杆菌模式种比较可以鉴定菌株rdx5为解淀粉芽孢杆菌。部分生理生化鉴定结果与标准的解淀粉芽孢杆菌生理生化特征有差异。例如：菌株rdx5不能利用阿拉伯糖/木糖产酸，也不能耐受7%nacl。但是我们又经过细菌的16srdna测序ncbi上比对，我们发现菌株rdx5与解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens（登录号：nr075005.1）具有最高的同源性，在mega6.0中，将与其有相关性的代表细菌共同建立系统发育进化树，认定其为解淀粉芽孢杆菌。

本发明具有以下有益效果：

本发明从中药材白芷中筛选出菌株rdx5，该菌株对水稻稻瘟病具有拮抗作用，同时菌株rdx5的次生代谢产物对水稻稻瘟病也具有强烈的拮抗作用。为稻瘟病防治提供了新的微生物菌种；菌株rdx5的1倍的发酵液过滤液浓度为0.025ml/ml对稻瘟病菌的抑制率达到了71.76％，抑菌效果好。

附图说明

图1为菌株rdx5单菌落在pda培养基上生长的形态图。

图2为菌株rdx5对稻瘟菌饼的拮抗作用的结果图；

图3为解淀粉芽孢杆菌rdx5发酵液浓度为0.05ml/ml的抑菌效果图；

图4为解淀粉芽孢杆菌rdx5发酵液浓度为0.025ml/ml的抑菌效果图；

图5为解淀粉芽孢杆菌rdx5发酵液浓度为0.0125ml/ml的抑菌效果图；

图6为空白对照抑菌效果图；

图7为解淀粉芽孢杆菌rdx5系统进化树；

图8为菌株rdx5产蛋白酶检测结果图；

图9为菌株rdx5产纤维素酶检测结果图；

图10为菌株rdx5产hcn检测结果图；

图11为菌株rdx5产明胶酶检测结果图；

图12为菌株rdx5产过氧化物酶检测结果图；

图13为菌株rdx5产几丁质酶检测结果图。

解淀粉芽孢杆菌rdx5，于2017年7月15日保存于中国典型培养物保藏中心（cctcc），其保存编号为cctccno:m2017406，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心。

具体实施方式

实施例1

解淀粉芽孢杆菌rdx5的筛选

在中国传统中药材库中筛选对稻瘟病相关的活性成分时，偶然发现从中药材白芷中筛选出的数株对稻瘟病有抑制作用的微生物，将这些微生物菌落挑取，接种于pda培养基中划线分离，30℃，恒温培养24小时，再次挑取单菌落进行培养，单菌落其余部分放入灭菌的含50％甘油的水溶液中于-20℃保存。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌rdx5拮抗菌抗生性研究

在pda培养基中央接种直径为6mm的稻瘟菌饼，采用对峙法在距离稻瘟菌饼2.5cm处接种菌株rdx-5，在28℃恒温培养箱中培养6天，观察结果。结果显示（见图2）解淀粉芽孢杆菌rdx-5具有强烈的抑制稻瘟病菌的效果。

实施例3

菌株rdx5的鉴定

a形态特征：pda培养基上28℃培养3天后，菌落有褶皱，菌落圆形，边缘整齐，电镜观察结果为：杆状，大小为0.5～0.8μm×1.2～2.4μm；用光学显微镜和扫描电子显微镜进行常规的菌落形态观察，该菌株在pda培养基上28℃培养24-36小时，革兰氏染色后光学显微镜结果为：革兰氏阳性菌。芽孢染色后光学显微镜结果为：产芽孢。鞭毛染色后光学显微镜结果为：有鞭毛，可运动。

b生理生化实验：参照《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》、东秀珠版《常见细菌系统鉴定手册》的内容对细菌进行生理生化的鉴定。

c、采用细菌通用引物：

p2：(5’-cagagtttgatcctggct-3’)；

p5：(5’-aggaggtgatccagccgca-3’)

对菌株rdx5的16srdna进行扩增测序，其序列如序列表所示，用得到的16srdna在ncbi上进行比对，与解淀粉芽孢杆菌的相似性达到99％，基本判定其为解淀粉芽孢杆菌。

实施例4

菌株次级代谢产物的抗生实验

解淀粉芽孢杆菌rdx5在landy培养基中28℃，180r/m培养48小时，将发酵液离心，0.22μm滤膜过滤收集滤液备用，取1.5ml滤液与58.5ml灭菌后冷却至50℃左右的pda液体培养基充分混匀，使发酵液滤液浓度为0.025ml/ml，然后倒入3个直径为9cm的灭菌培养皿，每个平板倒入20ml左右。待培养皿凝固后，将直径6mm的稻瘟菌饼接种于含有发酵液滤液的pda平板中心。同时也在不含发酵液滤液的pda平板中心接种稻瘟菌饼作为对照。30℃下恒温倒置培养6天，发酵液滤液浓度为0.025ml/ml抑菌效果如图4所示，同时，分别制备培养基中发酵液浓度为0.05ml/ml、0.0125ml/ml的平板，其抑菌结果分别如图3及图5所示。空白对照结果如图6所示。测量菌饼直径并计算抑制率，0.0125ml/ml、0.025ml/ml与0.05ml/ml的抑制率分别为67.12%、71.68%与75.67%。

由图3、4、5、6结果可知，本发明的解淀粉芽孢杆菌rdx5对稻瘟菌具有较强的抑制效果。

实施例5

解淀粉芽孢杆菌rdx5抑菌活性物质检测及抑菌机制：

1、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于蛋白酶检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后观察，菌落周围是否出现透明圈；如图8所示，菌落周围出现透明圈，结果说明菌株rdx5在培养过程中产生了蛋白酶。

2、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于纤维素酶检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后往培养皿中加入0.1%的刚果红染色10-15min，自来水冲洗干净后用1mol/l的氯化钠脱色15-20min，倒去氯化钠观察菌落周围是否出现透明圈，如图9所示，菌落周围出现透明圈，结果说明菌株rdx5在培养过程中产生了纤维素酶。

3、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于hcn检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后观察菌落周围是否由黄色变为橙色，红色，棕色。分别代表产hcn能力较弱，一般，很强。结果如图10所示，菌落周围无明显变化，说明菌落培养过程中不产生hcn。

4、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于明胶酶检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后于培养基表面注入氯化汞溶液，10min后倒去，观察菌落周围是否出现透明圈。结果如图11所示，菌落周围出现较大的透明圈，说明菌中培养过程中产生明胶酶。

5、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于过氧化物酶检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后观察菌落周围是否出现透明圈。结果如图12所示，菌落周围出现透明圈，说明产生过氧化物酶。

6、用接种环挑取活化的rdx5菌种接种于几丁质酶检测培养基中央，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养2d后观察菌落周围是否出现晕圈。结果如图13所示，菌落周围无明显变化，说明菌株rdx5不产生几丁质酶。

上述检测用培养基成分：

蛋白酶检测培养基：取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中，另称1.5g琼脂于50ml蒸馏水中，将两液121℃分开灭菌25min，待冷却至45-50℃时，将两液混匀倒平板。

纤维素检测培养基：羧甲基纤维素钠20g，磷酸氢二钠2.5g，磷酸二氢钾1.5g，蛋白胨2.5g，酵母㓎粉0.5g，琼脂15g，ph7.0，水1000ml，灭菌25min。

hcn检测培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，甘氨酸5g，三水氯化铁0.054g，琼脂16g，ph7.0，水1000ml，灭菌25min。

明胶酶检测培养基：一般固体培养基+5%明胶，灭菌25min。

过氧化物酶检测培养基：葡萄糖20g，酵母粉10g，苯胺蓝0.1g琼脂15g，自然ph，水1000ml，灭菌15min。

几丁质培养基：胶状几丁质4.5g，硫酸铵3g，七水硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸一水合物1g，吐温800.2ml，溴甲酚紫0.15g，琼脂15g，水1000ml，ph4.7，灭菌25min。

序列表

<110>四川农业大学

<120>解淀粉芽孢杆菌rdx5及其应用

<141>2017-10-23

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1653

<212>dna

<213>解淀粉芽孢杆菌rdx5(bacillusamyloliquefaciensrdx5)

<400>1

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