厌氧微生物培养基制备、接种及培养装置的制作方法

本发明涉及微生物培养技术领域，具体来说是一种实验室厌氧微生物培养基制备、接种及培养装置。

背景技术：

厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，作用也日益引起重视。厌氧微生物培养的关键是要使用该类微生物接种及培养时都处于无氧的环境中。

目前，厌氧微生物培养一般采用碱性焦性没食子酸法、厌氧罐培养法、疱肉培养基法及厌氧手套箱。

碱性焦性没食子酸法无需特殊及昂贵的设备，操作简单，适于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境，其缺点是在氧化过程中会产生少量的一氧化碳，对某些厌氧菌的生长有抑制作用。

厌氧罐不能实现培养基配制、微生物接种环节的厌氧环境，只能保证培养过程的厌氧环境。

疱肉培养基法常用于厌氧微生物的液体培养基培养，且通用性较差，只能适用特定厌氧微生物的培养。

厌氧培养箱虽既可用于厌氧微生物培养，也能厌氧微生物接种，但也存在许多不足，如操作不方便、仪器昂贵、体积较大、不适合极端厌氧微生物（如海底菌种、深层土壤菌种）培养基不能恒温。

厌氧手套箱也存在很多弊端：

（1）由于某些菌种需要在高压条件下方可生长，如取自海底菌种、取自深层土壤菌种但厌氧手套箱无法模拟不同的压力情况，至此海底菌种和土壤菌种无法在受压情况下正常生长，受用受限；

（2）不能整体随意放置，许多实验需要在恒温培养箱中进行。因此，设计并制备一种操作简易、成本低，且能够实现厌氧微生物培养基的制备、接种和培养于一体的厌氧培养装置极具意义。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种厌氧微生物培养基制备、接种及培养装置，该装置体积小、操作简单、价格低廉，可自由操作，适用各种环境的微生物培养。

一种厌氧微生物培养基制备、接种及培养装置，包括：气体钢瓶组1、浮子气体流量计组4、石英玻璃管11和曝气组件，所述气体钢瓶组1为三个分别装有n2、co2以及h2/co2的气体钢瓶（1.1、1.2、1.3）；

所述浮子气体流量计组4为三个浮子气体流量计（4.1、4.2、4.3）一端通过不锈钢管3分别与三个气体钢瓶（1.1、1.2、1.3）对应相连，第一浮子气体流量计4.1和第二浮子气体流量计4.2的另一端与第一卡套式三通接头5相连，继而第一卡套式三通接头5的出口端和第三浮子气体流量计4.3的另一端与卡套式三通球阀6相连，卡套式三通球阀6的出口端通过外套有橡胶管7的不锈钢管与石英玻璃管11底部相连通；

石英玻璃管11内装有紫铜丝10，石英玻璃管11外部缠绕玻璃纤维发热丝9并附有金属保护套，玻璃纤维发热丝连接单相接触式调压器19；

石英玻璃管11的顶部通过外套有橡胶管7的不锈钢管与第二卡套式三通接头5.1相连，第二卡套式三通接头5.1的一个出口端依次连有整体式阀帽针阀12、橡胶管14、玻璃注射器17、不锈钢针头18；第二卡套式三通接头5.1的另一个出口端连有整体式阀帽针阀12，继而并联有多个曝气组件，曝气组件之间以第三卡套式三通接头5.2相连通。

气体钢瓶出口设置有钢瓶减压阀2。

不锈钢管3为外径1/8英寸的不锈钢管。

曝气组件由拨动开关阀13、橡胶管14、不锈钢针头15、厌氧瓶16组成。

所述浮子气体流量计组4、卡套式三通接头（5、5.1、5.2）、卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12均安装在同一不锈钢板表面。

h2/co2气体钢瓶内装有氢气和二氧化碳气体。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、利用卡套式三通接头将两个浮子气体流量计连接，可实现了厌氧培养气氛组成的变化；

2、卡套式三通球阀实现了不同培养气氛之间的相互转换；

3、利用卡套式三通接头将两个整体式阀帽针阀相连以实现气路分流，通过调节两个整体式阀帽针阀可实现厌氧培养基制备与厌氧微生物接种的同时操作或单独操作；

4、石英玻璃管、紫铜丝、玻璃纤维发热丝和单相接触式调压器，实现了气体的在线脱氧；

本发明装置体积小，操作简单，价格低廉，可自由操作，同时满足厌氧微生物培养基的制备、接种及培养，适用各种环境、各种培养气氛的微生物培养。

附图说明

图1为本发明系统的整体结构示意图。

图2a为未接种geobactermetallireducensfc培养基；

图2b为接种geobactermetallireducens培养一周后fc培养基。

图3a为未接种geobactersulfurreducensnbf培养基；

图3b为接种geobactersulfurreducens培养一周后nbf培养基。

图4为geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture耦合代谢乙醇产甲烷曲线图。

图中，1为气体钢瓶组，1.1为第一气体钢瓶，1.2为第二气体钢瓶，1.3为第三气体钢瓶，2为钢瓶减压阀，3为不锈钢管，4为浮子气体流量计组，4.1为第一浮子气体流量计，4.2为第二浮子气体流量计，4.3为第三浮子气体流量计，5为第一卡套式三通接头，5.1为第二卡套式三通接头，5.2为第三卡套式三通接头，6为卡套式三通球阀，7为橡胶管，8为电线，9为玻璃纤维发热丝，10为紫铜丝，11为石英玻璃管，12为整体式阀帽针阀，13为拨动开关阀，14为橡胶管，15、18为不锈钢针头，16为厌氧瓶，17为玻璃注射器，19为单相接触式调压器。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步的描述，但并非对其保护范围的限制。

如图1-图4所示，一种厌氧微生物培养基制备、接种及培养装置，包括：气体钢瓶组1、浮子气体流量计组4、石英玻璃管11和曝气组件，所述气体钢瓶组1为三个分别装有n2、co2以及h2/co2的气体钢瓶（1.1、1.2、1.3）；

所述浮子气体流量计组4为三个浮子气体流量计（4.1、4.2、4.3）一端通过不锈钢管3分别与三个气体钢瓶（1.1、1.2、1.3）对应相连，第一浮子气体流量计4.1和第二浮子气体流量计4.2的另一端与第一卡套式三通接头5相连，继而第一卡套式三通接头5的出口端和第三浮子气体流量计4.3的另一端与卡套式三通球阀6相连，卡套式三通球阀6的出口端通过外套有橡胶管7的不锈钢管与石英玻璃管11底部相连通；

石英玻璃管11内装有紫铜丝10，石英玻璃管11外部缠绕玻璃纤维发热丝9并附有金属保护套，玻璃纤维发热丝连接单相接触式调压器19；可实现培养基及培养气氛的脱氧，解决了培养基及培养气氛里含有氧气导致厌氧微生物无法正常生长的情况；

石英玻璃管11的顶部通过外套有橡胶管7的不锈钢管与第二卡套式三通接头5.1相连，第二卡套式三通接头5.1的一个出口端依次连有整体式阀帽针阀12、橡胶管14、玻璃注射器17、不锈钢针头18；第二卡套式三通接头5.1的另一个出口端连有整体式阀帽针阀12，继而并联有多个曝气组件，曝气组件之间以第三卡套式三通接头5.2相连通。

气体钢瓶出口设置有钢瓶减压阀2。

不锈钢管3为外径1/8英寸的不锈钢管。

曝气组件由拨动开关阀13、橡胶管14、不锈钢针头15、厌氧瓶16组成。如此设计方便针头的换取与进行消毒处理，并能插入培养器皿中。

所述浮子气体流量计组4、卡套式三通接头（5、5.1、5.2）、卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12均安装在同一不锈钢板表面。

两个整体式阀帽针阀12实现了厌氧培养基的制备与厌氧微生物的接种既可以同时进行也可以单独操作。

本发明装置是这样实现的：

1、脱氧系统再生：当厌氧微生物接种及曝气装置使用一段时间后，石英玻璃管中的紫铜丝10会被氧化变黑，需对其进行还原。将单相接触式调压器19接通电源，接通与装有氢气的气体钢瓶相连的浮子气体流量计1.3，关闭另外两个浮子气体流量计，转动卡套式三通球阀6切换气体到氢气，打开整体式阀帽针阀12，待管内紫铜丝10由黑色变为紫红色，说明紫铜丝10被还原，脱氧系统再生完成。

2、厌氧培养基制备：打开装有氮气气体钢瓶1.1的减压阀和装有二氧化碳气体的气体钢瓶1.2的减压阀及其相连的浮子气体流量计4.1、4.2，关闭另外一个浮子气体流量计4.3，再打开卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12，卡套式三通球阀6起到转换气体的作用，并打开拨动开关阀13，下端接有14g不锈钢针头15，并把不锈钢针头15插在厌氧瓶16里进行曝气处理。

3、厌氧微生物的接种：打开装有氮气的气体钢瓶1.1的减压阀及其相连的浮子气体流量计4.1，关闭另外两个浮子气体流量计4.2和4.3，再打开卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12，卡套式三通球阀6起到转换气体的作用，玻璃注射器17、20g不锈钢针头18和外径5mm橡胶管14称为厌氧微生物接种装置。接种时接通电源，预热约30min，然后按照菌种培养要求拧卡套式三通球阀6换为氮气，并打开与外径5mm橡胶管14相连的整体式阀帽针阀12，使用厌氧微生物接种装置接种。

实施例一

厌氧菌geobactermetallireducens的培养

1、柠檬酸铁培养基制备

如图2a、图2b所示，使用柠檬酸铁（ferriccitrate，fc）作为电子受体培养厌氧微生物geobactermetallireducens。柠檬酸铁培养基的配制过程为：用电子天平称取柠檬酸铁13.7g待用，1l烧杯中取600ml去离子水放置于磁力加热搅拌器上，加入少量柠檬酸铁，待加入的柠檬酸铁完全后再次少量加入，维持边加入药剂边搅拌加热的状态，并在此过程中适量加入蒸馏水200ml左右，使柠檬酸铁更好的溶解，直到所有柠檬酸铁完全溶解后，先用10mol/l的naoh调节ph至6.0～6.5（当ph接近5.0时，用5mol/l或2mol/l的低浓度naoh调节），再用0.5mol/lnaoh调到7.0左右（6.8～7.2），待溶液冷却后分别加入nah2po4·h2o0.60g、nh4cl0.25g、kcl0.10g、nahco32.50g、1mmol/lna2seo4溶液1ml、微量元素溶液10ml（微量元素溶液组成：1.5g/l氨基三乙酸，3.0g/lmgso4·7h2o，1.0g/lnacl，0.13g/lzncl2，0.5g/lmnso4·h2o，0.1g/lfeso4·7h2o，0.1g/lcacl2·2h2o，0.1g/lcocl2·6h2o，0.01g/lh3bo3，0.01g/lcuso4·5h2o，0.01g/lkal(so4)2·12h2o，0.024g/lna2wo4·2h2o，0.025g/lna2moo4·2h2o，0.025g/lnicl2·2h2o），维生素溶液10ml（维生素溶液组成：0.002g/l生物素，0.005g/l泛酸，0.0001g/lb-12，0.005g/l对氨基苯甲酸，0.005g/l硫辛酸，0.005g/l烟酸，0.005g/l硫胺素，0.005g/l维生素b2，0.01g/l维生素b6，0.002g/l叶酸），定容至1000ml，配好的柠檬酸铁培养基分装至150ml厌氧培养瓶中，每瓶50ml，分装完成后用自制的厌氧微生物培养系统装置对其进行曝气处理，打开装有氮气气体钢瓶1.1的减压阀和装有二氧化碳气体的气体钢瓶1.2的减压阀及其相连的浮子气体流量计4.1、4.2，关闭另外一个浮子气体流量计4.3，再打开卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12，并打开拨动开关阀13，下端接有14g不锈钢针头15，并把针头插在厌氧瓶16里进行曝气以除氧。每瓶曝气时长为20min，曝气所用气体为二氧化碳与氮气的混合气（co2/n2=20/80）。柠檬酸铁培养基脱氧处理后121ºc，高压灭菌30min，冷却至室温待用。

2、geobactermetallireducens的接种与培养

接种时接通电源预热约30min，先将装有柠檬酸铁培养基的厌氧瓶瓶口放于酒精灯上稍加炙烤，然后用无菌注射器加入2mol/l醋酸钠溶液0.5ml，再将抽取菌种后的无菌注射器针头一端靠近接菌装置的玻璃注射器，打开装有氮气的气体钢瓶的减压阀及其相连的浮子气体流量计，关闭另外两个浮子气体流量计，再打开卡套式三通球阀和整体式阀帽针阀，然后按照菌种培养要求拧卡套式三通球阀换为氮气，并打开与外径5mm橡胶管相连的整体式阀帽针阀，玻璃注射器针头一端不断溢出厌氧气体，可保证接种环节处于厌氧状态，然后将菌种（geobactermetallireducens）注入培养基中，接种量为1ml，接种后放置于30ºc恒温培养箱中培养约一周。图2a为未接种geobactermetallireducens的柠檬酸铁培养基，图2b为接种geobactermetallireducens培养一周后的柠檬酸铁培养基，从图中能够看出培养基颜色由红棕色变为浅黄色，说明利用厌氧微生物接种与培养装置创造的厌氧环境满足geobactermetallireducens的生长需求，该装置可用于严格厌氧微生物的接种与培养。

实施例二

厌氧菌geobactersulfurreducens的培养

1、nbf（nbmediumwithfumarate）培养基的制备

实验以nbf培养基培养严格厌氧电活性细菌geobactersulfurreducens。nbf培养基的配制过程为：用电子天平称取富马酸4.64g待用，1l烧杯中取800ml去离子水，加入富马酸，待加入的富马酸完全溶解后，先用10mol/l的naoh调节ph至6.5～7.0（当ph接近6.0时，用10mol/l或2mol/l低浓度naoh调节），调到7.0左右（6.8～7.2），待溶液冷却后分别加入cacl2·2h2o0.04g、mgso4·7h2o0.1g、kcl0.10g、nahco31.8g、na2co3·h2o0.5g、1mmol/lna2seo4溶液1.0ml、100xnb盐溶液10ml（nb盐溶液组成：42g/lk2hpo4，22g/lkh2po4，20g/lnh4cl，36g/lnacl，38g/lkcl），nb微量元素溶液10ml（nb微量元素溶液组成：2.14g/l氨基三乙酸，0.1g/lmncl2·4h2o，0.3g/lmgso4·7h2o，0.2g/lznso4·7h2o，0.17g/lcocl2·6h2o，0.005g/lh3bo3，0.03g/lcucl2·2h2o，0.005g/lkal(so4)2·12h2o，0.02g/lna2wo4·2h2o，0.9g/lna2moo4·2h2o，0.11g/lniso4·6h2o），维生素溶液15ml（维生素溶液组成：0.002g/l生物素，0.005g/l泛酸，0.0001g/lb-12，0.005g/l硫辛酸，0.005g/l烟酸，0.005g/l硫胺素，0.005g/l维生素b2，0.002g/l叶酸），定容至1000ml。将配制完成的nbf溶液分装至150ml厌氧培养瓶中，每瓶50ml，分装完成后用自制的厌氧微生物培养系统装置对其进行曝气处理，打开装有氮气气体钢瓶1.1的减压阀和装有二氧化碳气体的气体钢瓶1.2的减压阀及其相连的浮子气体流量计4.1、4.2，关闭另外一个浮子气体流量计4.3，再打开卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12，并打开拨动开关阀13，下端接有14g不锈钢针头15，并把针头插在厌氧瓶16里进行曝气以除氧。每瓶曝气时长为20min，曝气所用气体为二氧化碳与氮气的混合气（co2/n2=20/80）。nbf培养基脱氧处理后121ºc，高压灭菌30min，冷却至室温待用。

2、geobactersulfurreducens的接种与培养

接种时接通电源预热约30min，先将装有nbf培养基的厌氧瓶瓶口放于酒精灯上稍加炙烤，然后用无菌注射器加入2mol/l醋酸钠溶液0.5ml，再将抽取菌种后的无菌注射器针头一端靠近接菌装置的玻璃注射器，打开装有氮气的气体钢瓶的减压阀及其相连的浮子气体流量计，关闭另外两个浮子气体流量计，再打开卡套式三通球阀和整体式阀帽针阀，然后按照菌种培养要求拧卡套式三通球阀换为氮气，并打开与外径5mm橡胶管相连的整体式阀帽针阀，玻璃注射器针头一端不断溢出厌氧气体，可保证接种环节处于厌氧状态，然后将菌种注入培养基中，接种量为1ml，接种后放置于30ºc恒温培养箱中培养约一周。图3a为未接种geobactersulfurreducensnbf培养基的实物图，图3b为接种geobactersulfurreducens并培养一周后的nbf培养基，从图中能够看出培养基颜色由无色变为粉红色，这表明该厌氧环境同样满足厌氧菌geobactersulfurreducens的生长需求，菌种长势良好。

实施例三

geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture耦合代谢乙醇产甲烷

1、nbm（nbmodifiedmedium）培养基的制备

实验以nbm（medianbmodified）为基本培养基，并利用自制实验室简易厌氧微生物接种及培养装置培养geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture耦合代谢乙醇产甲烷，以检验该装置的有效性。nbm培养基的配制过程：先在烧杯中加入蒸馏水约800ml，用naoh调节ph至7.0，待溶液冷却后分别加入cacl2·2h2o0.3g、mgso4·7h2o0.3g、feso4·7h2o17mg、na2co3·h2o0.5g、nahco31.8g、100xnb盐溶液10ml（nb盐溶液组成：42g/lk2hpo4，22g/lkh2po4，20g/lnh4cl，36g/lnacl，38g/lkcl)，nb微量元素溶液10ml（nb微量元素溶液组成：2.14g/l氨基三乙酸，0.1g/lmncl2·4h2o，0.3g/lmgso4·7h2o，0.2g/lznso4·7h2o，0.17g/lcocl2·6h2o，0.005g/lh3bo3，0.03g/lcucl2·2h2o，0.005g/lkal(so4)2·12h2o，0.02g/lna2wo4·2h2o，0.9g/lna2moo4·2h2o，0.11g/lniso4·6h2o），1mmol/lna2seo41ml，定容至1000ml，然后将nbm培养基置于三角瓶中，用铝箔纸密封后煮沸，将煮沸的培养基置于冰域中，冷却至室温。将配制完成的nbm溶液用自制的厌氧微生物培养系统装置对其进行曝气处理（如图1），打开装有氮气气体钢瓶1.1的减压阀和装有二氧化碳气体的气体钢瓶1.2的减压阀及其相连的浮子气体流量计4.1、4.2，关闭另外一个浮子气体流量计4.3，再打开卡套式三通球阀6和整体式阀帽针阀12，并打开拨动开关阀13，下端接有14g不锈钢针头15，并把针头插在厌氧瓶16里进行曝气，每瓶曝气时长为20min，曝气所用气体为二氧化碳与氮气的混合气（co2/n2=20/80）。nbm培养基脱氧处理后121ºc，高压灭菌30min，冷却至室温待用。

2、geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture的接种与培养

接种时接通电源预热约30min，将装有nbm培养基的厌氧瓶瓶口放于酒精灯上稍加炙烤，然后通过接种气路用1ml注射器加入0.50ml过滤灭菌的微量维生素溶液（维生素溶液组成：0.002g/l生物素，0.005g/l泛酸，0.0001g/lb-12，0.005g/l硫辛酸，0.005g/l烟酸，0.005g/l硫胺素，0.005g/l维生素b2，0.002g/l叶酸）、0.5ml还原剂（100mmol/ll-cysteine和50mmol/l的na2s混合溶液）及0.5ml乙醇溶液（2mol/l）。将接种用的无菌注射器针头一端靠近接菌装置的玻璃注射器，打开装有氮气的气体钢瓶的减压阀及其相连的浮子气体流量计，关闭另外两个浮子气体流量计，再打开卡套式三通球阀和整体式阀帽针阀，然后按照菌种培养要求拧卡套式三通球阀换为氮气，并打开与外径5mm橡胶管相连的整体式阀帽针阀，玻璃注射器针头一端不断溢出厌氧气体，可保证接种环节处于厌氧状态，然后将methanosarsinabarkeri800与geobactermetallireducens的co-culture注入nbm培养基中（接种量为10%，v/v），置于37ºc下培养，并利用气相色谱定期检测厌氧瓶上空甲烷气体浓度。geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture厌氧瓶中甲烷的浓度随时间变化如图4所示。由图可知：前20d甲烷的浓度为0，20d后甲烷浓度急剧上升，这说明使用自制实验室多功能厌氧微生物接种及培养装置成功地培养了geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture。geobactermetallireducens与methanosarsinabarkeri800co-culture都为严格厌氧微生物，而两种微生物在自制的装置中都能生长，这充分说明了该装置在严格厌氧微生物的接种及培养时的有效性。