一种含有干细胞成分的组合物及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有干细胞成分的组合物及其应用。

背景技术：
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衰老研究已经成为生命科学领域的重大研究课题，纵然衰老不可遁免，但这不能阻止人类追求美的权利。近几年抗衰老药物的研究一直的人们关注的重点。抗衰老药物是一类延缓衰老的重要工具，提高生命效率为目的药物。研究表明抗氧化剂可清除自由基，防止自由基破坏生物膜，具有一定的延缓衰老的作用，对选择药物进行抗氧化实验测试。研究表明干细胞、天然产物和很多化合物具有抗衰老作用，而皮肤的衰老是机体衰老的直接反应，故选择人皮肤成纤维细胞hsf研究产物的抗衰老作用，从而为干细胞在抗衰老中的应用提供理论和实验基础。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种含有干细胞成分的组合物及其应用，其通过抗氧化实验测定产物抗氧化性能，建立氧化应激细胞衰老模型，对干细胞组合物进行抗衰老功能研究，从而找到具有多重功效的、毒副作用较小的具有抗衰老功效的干细胞组合物。

本发明提供一种含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，包括干细胞浓缩液20％～100％和完全培养基0～80％，所述的组合物中还添加有维生素e和pdgf(血小板衍生因子)。完全培养基为添加有10～15v/v％胎牛血清的高糖dmem完全培养基，胎牛血清和dmem基础培养基都为gibco公司产品。

本发明通过抗氧化实验测定产物抗氧化性能，建立氧化应激细胞衰老模型，对含有干细胞成分的组合物进行抗衰老功能研究，从而找到具有多重功效的、毒副作用较小的具有抗衰老功效的干细胞组合物。

优选地，所述的维生素e的浓度为0.01～100μmol/ml，所述的pdgf的浓度为0.0001～1μg/ml。

优选地，所述的干细胞浓缩液用如下制备方法得到：收集传代前的细胞培养上清液，得到细胞培养液；过滤，滤掉细胞碎片及微生物，得到过滤液；过滤液置于5k的超滤管中离心，得到干细胞浓缩液，置于-20℃储存备用。所述的离心温度为-4℃～8℃，离心速度为800～5000r/min，干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞中的一种。

优选地，所述的含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，包括干细胞浓缩液20％～40％和完全培养基60％～80％，所述的组合物中还添加有浓度为1～10μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf，组合物的抗氧化抗衰老效果好。

含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，干细胞浓缩液40％和完全培养基60％，所述的组合物中还添加有浓度为10μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf时，组合物的抗氧化抗衰老效果最好。

本发明还提供了一种抗衰老制剂，含有有效量的上述含有干细胞成分的组合物。

本发明还提供了含有干细胞成分的组合物在化妆品和保健品中的应用。

除非另有说明，本发明涉及的名词定义具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。

与现有的技术相比，本发明的具有以下优点：本发明提供了一种含干细胞成分的组合物，该组合物具有良好的抗氧化抗衰老作用，可以广泛应用于化妆品和保健品。

附图说明：

图1是本发明实施例1各组合物在不同条件下的hsf细胞存活率比较图；

图2是本发明实施例2各组合物在不同条件下的hsf细胞存活率比较图；

图3是本发明实施例3各组合物在不同条件下的hsf细胞存活率比较图。

具体实施方式：

为了描述本发明，以下列出了实施例。但需要理解，本发明不限于这些实施例，只是提供实践本发明的方法。

实验例1：

干细胞浓缩液的制备：收集传代前的细胞培养上清液，得到干细胞培养液；过滤，滤掉细胞碎片及微生物；过滤液置于5k的超滤管中低温(-4℃～8℃)高速离心，离心速度为800～5000r/min，得到干细胞浓缩液，置于-20℃储存备用。本实验例中干细胞为胚胎干细胞。

活性检测方法：h2o2诱导细胞衰老模型

1、h2o2诱导细胞衰老模型的建立，确立h2o2刺激时间和浓度

活细胞线粒体中的唬泊酸脱氢酶能将外源性的mtt还原为难溶性的蓝紫色甲攒，且蓝紫色甲攒形成的量与活细胞数和细胞生物合成代谢能力成正比，死细胞无此功能。故通过mtt法测定hsf细胞存活率，选定h2o2刺激时间。

人皮肤成纤维细胞(hsf)生长至80％融合时，按细胞传代的方法制备单细胞悬液，用细胞计数法计算单细胞悬液的细胞浓度，细胞浓度为2-3×10⁴个/ml。在96孔板中每孔先加入100μl高糖dmem完全培养基，再加入100μl细胞浓度为2-3×10⁴个/ml的单细胞悬液，接种3个96孔板，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养，24h后对细胞进行处理。

用高糖dmem完全培养基稀释h2o2，使h2o2终浓度为300μmol/l，依次加入不同的孔板，各孔板边缘处不做处理，将孔板中的新鲜高糖dmem完全培养基和单细胞悬液吸除，然后每个孔板第1排(6孔)加入200μl高糖dmem完全培养基作为空白对照组，第2排(6孔)每孔中分别加入h2o2浓度为100μmol/l的100μl高糖dmem完全培养基和100μl干细胞浓缩液，第3排(6孔)每孔中分别加入h2o2浓度为200μmol/l的100μl高糖dmem完全培养基和100μl干细胞浓缩液，第4排(6孔)每孔中分别加入h2o2浓度为500μmol/l的100μl高糖dmem完全培养基和100μl干细胞浓缩液，第5排(6孔)每孔中分别加入h2o2浓度为1000μmol/l的100μl高糖dmem完全培养基和100μl干细胞浓缩液，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。1h后取出孔板，空白对照组不做处理，分别对3个孔板中的第2～5排进行处理，吸除含有h2o2的高糖dmem完全培养基和干细胞浓缩液，加入200μl高糖dmem完全培养基，即为h2o2刺激1h组。h2o2刺激2h,4h,8h,24h同样方法处理细胞。细胞处理结束将该96孔板放入二氧化碳培养箱继续培养。2～4d待细胞在孔板中生长至80％融合状态时，取出，每孔直接加入无菌pbs配制的mtt(5mg/ml)40μl，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡溶解10min，使结晶紫充分溶解。用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，计算细胞存活率，选出最佳h2o2刺激时间和h2o2刺激浓度。

细胞存活率＝各浓度平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值×100％。

所有数据均采用spss19.0软件进行统计学分析，数据以6个平行的平均值土标准差(x土s)表示。两组间比较采用独立样本t检验，p<0.05被认为有统计学意义。两组间数字不同代表有显著性差异。经过统计分析，发现用300μmol/lh2o2刺激hsf细胞1h的处理方法建立的抗氧化模型最为合适。接下来的实施例将用这种最优方法处理细胞。

2、h2o2刺激浓度对hsf阳性率的影响

按细胞传代的方法制备单细胞悬液，接种在96孔板中，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。24h后，空白对照组不做处理，实验组直接加入h2o2浓度为300μmol/l的200μl高糖dmem完全培养基，1h后吸除96孔板中的培养基，用pbs洗涤2次，换上干细胞培养液，继续培养。2-4d待细胞在孔板中生长至80％融合状态时，取出，每孔直接加入无菌pbs配制的mtt(5mg/ml)40μl，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡溶解10min，使结晶紫充分溶解。用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，计算细胞存活率，选出最佳h2o2刺激时间。

细胞存活率＝各浓度平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值×100％。

所有数据均采用spss19.0软件进行统计学分析，数据以6个平行的平均值土标准差(x土s)表示。两组间比较采用独立样本t检验，p<0.05被认为有统计学意义。两组间数字不同代表有显著性差异。

实施例1：

一种含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，包括干细胞浓缩液20％和高糖dmem完全培养基80％，还添加有1μmol/ml的维生素e和0.0001～1μg/ml的pdgf。在本实施例中，干细胞浓缩液为胚胎干细胞浓缩液。胚胎干细胞来源于中国科学院细胞库。

采用sas方法设计了多组组合物，分别是：

(1)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，还添加有1μmol/ml的维生素e和0.0001μg/ml的pdgf；

(2)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，还添加有1μmol/ml的维生素e和0.001μg/ml的pdgf；

(3)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，还添加有1μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(4)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，还添加有1μmol/ml的维生素e和0.1μg/ml的pdgf；

(5)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，还添加有1μmol/ml的维生素e和1μg/ml的pdgf；

(6)对照组为高糖dmem完全培养基。

将上述组合物参照实验例1的步骤，人皮肤成纤维细胞(hsf)生长至80％融合时，按细胞传代的方法制备单细胞悬液，用细胞计数法计算单细胞悬液的细胞浓度，细胞浓度为2-3×10⁴个/ml。在96孔板中每孔先加入100μl新鲜高糖dmem完全培养基，再加入100μl细胞浓度为2-3×10⁴个/ml的单细胞悬液，接种3个96孔板，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。

培养24h后，将96孔板中的新鲜细胞培养液和单细胞悬液吸除，依次加入200ul的300μmol/lh2o2，并用高糖dmem完全培养基作为空白对照组，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。1h后取出孔板，空白对照组不做处理，其他孔吸除含有h2o2的高糖dmem完全培养基和单细胞悬液，分别加入200μl上述组合物(1)～(5)。细胞处理结束将该96孔板放入二氧化碳培养箱继续培养。2～4d待细胞在孔板中生长至80％融合状态时，取出，每孔直接加入无菌pbs配制的mtt(5mg/ml)40μl，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡溶解10min，使结晶紫充分溶解。用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，计算各个混合物的细胞存活率。

使用h2o2诱导细胞衰老模型，h2o2刺激时间为1h，h2o2刺激浓度为300μmol/l，经计算得出hsf细胞存活率，结果如图1所示，从图1可看出：质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基，添加有1μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf的组合对h2o2诱导hsf细胞的存活率有明显提高，说明该组合物具有良好的抗氧化抗衰老作用。

实施例2：

一种含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，包括干细胞浓缩液40％和高糖dmem完全培养基60％，还添加有浓度为0.01～100μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf。在本实施例中，干细胞浓缩液为成体干细胞浓缩液。成体干细胞来源于广东省脐带血造血干细胞库。

采用sas方法设计了多组组合物，分别是：

(1)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，还添加有浓度为0.01μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf；

(2)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，还添加有浓度为0.1μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf；

(3)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，还添加有浓度为1μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf；

(4)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，还添加有浓度为10μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf；

(5)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，还添加有浓度为100μmol/ml的维生素e和浓度为0.01μg/ml的pdgf；

(6)对照组为高糖dmem完全培养基。

将上述组合物参照实验例1的步骤，人皮肤成纤维细胞(hsf)生长至80％融合时，按细胞传代的方法制备单细胞悬液，用细胞计数法计算单细胞悬液的细胞浓度，细胞浓度为2-3×10⁴个/ml。在96孔板中每孔先加入100μl新鲜高糖dmem完全培养基，再加入100μl细胞浓度为2-3×10⁴个/ml的单细胞悬液，接种3个96孔板，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。

培养24h后，将96孔板中的新鲜细胞培养液和单细胞悬液吸除，依次加入200ul的300μmol/lh2o2，并用高糖dmem完全培养基作为空白对照组，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。1h后取出孔板，空白对照组不做处理，其他孔吸除含有h2o2的高糖dmem完全培养基和单细胞悬液，分别加入200μl上述组合物(1)～(5)。细胞处理结束将该96孔板放入二氧化碳培养箱继续培养。2～4d待细胞在孔板中生长至80％融合状态时，取出，每孔直接加入无菌pbs配制的mtt(5mg/ml)40μl，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡溶解10min，使结晶紫充分溶解。用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，计算各个混合物的细胞存活率。

使用h2o2诱导细胞衰老模型，h2o2刺激时间为1h，h2o2刺激浓度为300μmol/l，经计算得出hsf细胞存活率，结果如图2所示，从图2可看出：质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf的组合对h2o2诱导hsf细胞的存活率有明显提高，说明该组合物具有良好的抗氧化抗衰老作用。

实施例3：

一种含有干细胞成分的组合物，按总质量分数100％计，包括干细胞浓缩液20％～100％，高糖dmem完全培养基为0～80％，还添加有10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf。在本实施例中，干细胞浓缩液为成体诱导多能干细胞浓缩液。成体诱导多能干细胞来源于中国科学院广州生物医药与健康研究院诱导多能干细胞库。

采用sas方法设计了多组组合物，分别是：

(1)质量分数为20％的干细胞浓缩液和质量分数为80％的高糖dmem完全培养基、10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(2)质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基、10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(3)质量分数为60％的干细胞浓缩液和质量分数为40％的高糖dmem完全培养基、10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(4)质量分数为80％的干细胞浓缩液和质量分数为20％的高糖dmem完全培养基、10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(5)质量分数为100％的干细胞浓缩液、10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf；

(6)对照组为高糖dmem完全培养基。

将上述组合物参照实验例1的步骤，人皮肤成纤维细胞(hsf)生长至80％融合时，按细胞传代的方法制备单细胞悬液，用细胞计数法计算单细胞悬液的细胞浓度，细胞浓度为2-3×10⁴个/ml。在96孔板中每孔先加入100μl新鲜高糖dmem完全培养基，再加入100μl细胞浓度为2-3×10⁴个/ml的单细胞悬液，接种3个96孔板，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。

培养24h后，将96孔板中的新鲜细胞培养液和单细胞悬液吸除，依次加入200ul的300μmol/lh2o2，并用高糖dmem完全培养基作为空白对照组，静置15min，轻轻放入二氧化碳培养箱培养。1h后取出孔板，空白对照组不做处理，其他孔吸除含有h2o2的高糖dmem完全培养基和单细胞悬液，分别加入200μl上述组合物(1)～(5)。细胞处理结束将该96孔板放入二氧化碳培养箱继续培养。2～4d待细胞在孔板中生长至80％融合状态时，取出，每孔直接加入无菌pbs配制的mtt(5mg/ml)40μl，轻微振荡混匀，放入培养箱中继续孵育4h终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡溶解10min，使结晶紫充分溶解。用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，计算各个混合物的细胞存活率。

使用h2o2诱导细胞衰老模型，h2o2刺激时间为1h，h2o2刺激浓度为300μmol/l，经计算得出hsf细胞存活率，结果如图3所示，从图3可看出：质量分数为40％的干细胞浓缩液和质量分数为60％的高糖dmem完全培养基，10μmol/ml的维生素e和0.01μg/ml的pdgf的组合对h2o2诱导hsf细胞的存活率有明显提高，说明该组合物具有良好的抗氧化抗衰老作用。