本发明属于细胞或细胞器处理液
技术领域：
：，具体涉及一种高效线粒体转移液及其制备方法。
背景技术：
：：线粒体是为细胞提供能量的细胞器，它具有自身的一套dna(mtdna)，通过母亲的卵子传递给下一代。发生在卵子中的线粒体突变可能引起母系家族性疾病。这种突变会导致严重的问题，受影响的大多数是能量需求高的器官，例如大脑、肌肉、心脏，涉及到一系列广泛的母源性遗传病。线粒体内的dna序列也可在发育和衰老过程中产生突变，这种新发突变只在患者身上出现，而不在其生母身上出现。目前的治疗方案极为有限，患者只能靠药物短期缓解症状，无法治愈。由于大多数线粒体疾病的线粒体dna是通过卵胞质以母源性遗传的方式进入下一代，故医生通常建议具有一定量线粒体dna突变的女性不进行生育。因此，线粒体疾病给家庭带来痛苦和不幸【lightowlers,r.n.,taylor,r.w.&turnbull,d.m.mutationscausingmitochondrialdisease:whatisnewandwhatchallengesremain？science349,1494-9(2015).】。在没有通过基因解码技术对生育过程进行干预和优化的自然生育过程中，保守估计每5000个活体婴儿会有一个人罹患线粒体疾病。线粒体疾病可以由细胞核dna异常或者线粒体dna异常引起。目前与人类线粒体的基因序列有关的疾病共有178种，有1363个基因参与线粒体正常活动的进行，参与疾病的发生。已经发现有3711个基因序列变化可以导致线粒体疾病的发生【shen,l.etal.mseqdr:acentralizedknowledgerepositoryandbioinformaticswebresourcetofacilitategenomicinvestigationsinmitochondrialdisease.hummutat37,540-8(2016).】基因解码技术的出现为快速准确鉴定线粒体疾病提供了一个经济有效的方法，也为精准治疗提供了可能。不管是来自于线粒体dna的异常，还是核基因组dna的突变，基因序列的变化引起的疾病被认为最有效的方法是采用基因矫正的方法。但是线粒体基因组的异质性、临床表征的多样性及将外源基因物质导入线粒体中的难度使得线粒体基因病的基因治疗变得异常困难【taylor,r.w.&turnbull,d.m.mitochondrialdnamutationsinhumandisease.natrevgenet6,389-402(2005).】。目前，由线粒体基因序列变化引起的疾病的治疗方案主要有异位基因表达法和线粒体置换法。在异位基因表达法中，在细胞核内表达线粒体蛋白，这种在细胞核表达的蛋白质可以部分恢复线粒体基因异常引起疾病达到治疗作用【taylor,r.w.&turnbull,d.m.mitochondrialdnamutationsinhumandisease.natrevgenet6,389-402(2005).】。线粒体捐献通过辅助生殖技术用来替换母亲所携带的、基因有缺陷的线粒体，从而消除后代因为获得母亲本身的线粒体而导致病的疾病【amato,p.,tachibana,m.,sparman,m.&mitalipov,s.three-parentinvitrofertilization:genereplacementforthepreventionofinheritedmitochondrialdiseases.fertilsteril101,31-5(2014).】，英国通过立法确认使用该技术的合法性【dimond,r.&stephens,n.threepersons,threegeneticcontributors,threeparents:mitochondrialdonation,geneticparentingandtheimmutablegrammarofthe'threexx'.health(london),1363459316689380(2017).】。但是这项技术只能用来在未生育时已明确的线粒体基因病，用来避免线粒体基因缺陷母亲生育疾病后代，不能用来治疗已经孕育的胚胎或患有线粒体疾病的成人。在进行线粒体的转移时，最常用的方法是直接孵化法。在这个方法中，新制备的线粒体采用新鲜配制的培养基进行悬浮，然后用含有线粒体的培养基与培养细胞进行孵化培养，从而使线粒体进入到培养细胞中。在细胞培养基中，一般会存在丰富的钙离子和动物血清；钙离子的存在会损伤线粒体的活性，从而降低线粒体的整体转移效率；并且血清因为成分过于复杂，如果用在动物活体实验、人体注射液中，会引起严重的排异反应、过敏反应。综上，现有技术中还没有一种既能保持线粒体活性，还能不引起活体产生排异、过敏反应的线粒体转移液。技术实现要素：为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种转移液及其制备方法，特别是一种线粒体转移液及其制备方法。所述线粒体转移液不含钙离子和动物血清，既能保持线粒体活性，同时不引起活体产生排异、过敏反应，还能够满足线粒体转移的需要，可在体内、体外使用。需要说明的是，所述线粒体转移液不仅能用于转移线粒体，还能够用来转移其他细胞器、质体、溶酶体、液泡，也可以用来进行细胞与细胞间的融合。本发明的目的是提供一种线粒体转移液。本发明的再一目的是提供一种所述线粒体转移液的制备方法。根据本发明的线粒体转移液，所述线粒体转移液包括以下组分：缓冲剂、等渗剂、钙螯合剂、定向耦合促进剂、线粒体活性促进剂和线粒体渗透通道抑制剂。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述缓冲液为hepes缓冲液，所述hepes缓冲液中hepes的浓度为10-30mmol/l。hepes为4-羟乙基哌嗪乙磺酸的简称。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述等渗液为蔗糖溶液，所述蔗糖的浓度为0.8-1.2mol/l。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述定向耦合促进剂为retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺，所述retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺的浓度为40-60mmol/l。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述钙螯合剂为egta，所述egta的浓度为0.3-0.7mmol/l。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述线粒体活性促进剂包括谷氨酸、马来酸、琥珀酸和脱氧腺苷二磷酸；所述谷氨酸的浓度为3-7mmol/l、马来酸的浓度为3-7mmol/l，琥珀酸的浓度为3-7mmol/l和脱氧腺苷二磷酸的浓度为0.5-1.5mmol/l。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述线粒体渗透通道抑制剂为ruo360，ruo360的化学名称叫做(μ-oxo)bis(trans-formatotetramineruthenium)，是一种由近乎线性的，由两个钌原子通过氧桥结合，与氨基配位结合的络合物。所述ruo360的浓度为0.05-0.15mmol/l。根据本发明的线粒体转移液，其中，所述缓冲液为hepes缓冲液，所述等渗液为蔗糖溶液，所述定向耦合促进剂为retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺，所述钙螯合剂为egta，所述线粒体活性促进剂包括谷氨酸、马来酸、琥珀酸和脱氧腺苷二磷酸，所述线粒体渗透通道抑制剂为ruo360；所述hepes缓冲液中hepes的浓度为20mmol/l，所述蔗糖的浓度为0.8-1.2mol/l，所述retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺的浓度为50mmol/l，所述egta的浓度为0.5mmol/l，所述谷氨酸的浓度为5mmol/l，马来酸的浓度为5mmol/l，琥珀酸的浓度为5mmol/l和脱氧腺苷二磷酸的浓度为1mmol/l，所述ruo360的浓度为0.1mmol/l。以上浓度，均为各组分添加混合后的最终浓度。根据本发明所述线粒体转移液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：先使用一部分水，将所有组分溶解后，调节ph值至7.0-7.4，并加入剩余部分的水，搅拌均匀即可。根据本发明所述线粒体转移液的制备方法，其中，使用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调至7.2；搅拌均匀，然后使用0.25um的滤膜过滤灭菌后放置在4℃的环境中保存。本发明的有益效果为：1、所述线粒体转移液中不含有钙离子和动物血清，同时采用钙螯合剂(egta螯合剂)固定环境中的残量钙离子从而降低钙离子线粒体的损害，增加有效线粒体的转移。2、由于所述线粒体转移液的稳定性和低致敏性，能够在体外实验和体内实验均采用同一种转移液，可以增加临床前研究、临床研究数据的一致性，加快线粒体转移在基因治疗、基因矫正中的审批，大幅度降低研究开发成本。3、线粒体的渗透通道，在钙离子的作用下，会激活线粒的散热机制，造成线粒体损伤。所述线粒体转移液中采用线粒体渗透通道抑制剂(即线粒体钙摄取抑制剂，ruo360)，通过抑制线粒体的钙摄取，增加线粒体的转移效率。4、所述线粒体转移液中添加了线粒体活性促进剂(谷氨酸、马来酸、琥珀酸和adp)，通过增加线粒体代谢中间物，增加线粒体关键酶的稳定性和活性。5、所述线粒体转移液中添加了定向耦合促进剂，采用人工设计的蛋白质多肽可以通过分子间作用力将线粒体锚定在细胞上，增加线粒体的内吞作用，从而大幅度提高线粒体的转移效率。6、所述线粒体转移液的制备方法，操作简单，适合大规模推广使用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是采用dmem高糖培养液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图；图2是采用hepes转移液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图；图3是采用egta转移液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图；图4是采用偶联剂转移液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图；图5是采用代谢中间产物转移液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图；图6是采用完全转移液转移线粒体所得细胞的耗氧率折线图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1一种线粒体转移液，所述线粒体转移液的组合及用量如表1所示：表1：线粒体转移液的成分表总体积：1l；其中，jxnano-偶联剂为retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺。所述线粒体转移液的制备方法为：取1l的量杯，加600ml超纯水，分别取所述线粒体转移液的各组分，按次序加入到超纯水中，边搅动边加入，直至全部溶解。用1m盐酸或naoh调节ph值到7.0，继续添加超纯水至950ml，用1m盐酸或naoh调节ph值到ph值到7.0，添加超纯水至1升，使用0.25um的滤膜过滤灭菌，放在4度冰箱备用。实施例2一种线粒体转移液，所述线粒体转移液的组合及用量如表2所示：表2：线粒体转移液的成分表总体积：1l；其中，jxnano-偶联剂为retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺。所述线粒体转移液的制备方法为：取1l的量杯，加600ml超纯水，分别取所述线粒体转移液的各组分，按次序加入到超纯水中，边搅动边加入，直至全部溶解。用1m盐酸或naoh调节ph值到7.4，继续添加超纯水至950ml，用1m盐酸或naoh调节ph值到ph值到7.4，添加超纯水至1升，使用0.25um的滤膜过滤灭菌，放在4度冰箱备用。实施例3一种线粒体转移液，所述线粒体转移液的组合及用量如表3所示：表3：线粒体转移液的成分表总体积：1l；其中，jxnano-偶联剂为retwwetwwtewsqprrrrkv-巯基乙胺。所述线粒体转移液的制备方法为：取1l的量杯，加600ml超纯水，分别取所述线粒体转移液的各组分，按次序加入到超纯水中，边搅动边加入，直至全部溶解。用1m盐酸或naoh调节ph值到7.2，继续添加超纯水至950ml，用1m盐酸或naoh调节ph值到ph值到7.2，添加超纯水至1升，使用0.25um的滤膜过滤灭菌，放在4度冰箱备用。实验例本实验例为使用实施例3得到的所述线粒体转移液和不添加各种组分的转移液作为对比。用dmem高糖培养基(glutmax4.5g/l，10％小牛血清，100mg/ml丙酮酸钠，50mg/ml尿嘧啶和抗生素、抗霉素(购自thermofisher)，在直经为3厘米的培养皿中，培养m0hela细胞到80％的密度，移走培养基，用无钙pbs溶液洗涤培养皿，加入新鲜配制的线粒体悬浮液2ml，109个/毫升。在室温下温孵2个小时，加入2ml完全培养基。继续培养24小时。进行线粒体耗氧率检测比较。采用不同细粒体转移液转移的细胞及没有进行线粒转移的细胞，采用0.5胰蛋白酶edta溶液消化制备细胞3×106悬浮液，悬浮液采用dmem高糖培养，其中含有10％小牛血清，100mg/ml丙酮酸钠，50mg/ml尿嘧啶和抗生素-抗霉素。将细胞液置于oxytherm小室中，每10分钟测定一次耗氧率，每个样品测定6次，根据检测结果绘制细胞的耗氧率曲线。纵坐标表示耗氧率，单位是pmol/min，横坐标表示时间，以分钟作为单位(纵坐标轴，单位pmol/min，横坐标轴：min)。实验结果如图1-6所示，实验数据表明，没有经过线粒体转移的组，耗氧率为基线水平，dmem高糖培养液和由hepes配制的基础转移液线粒体转移效率相当(图1，图2)，添加偶联剂、代谢中间产物和egta单独都可以有效提高线粒体的转移效率(图3，4，5)。但三种成分同时存在时，线粒体的转移效果最佳，达到最高水平，与正常野生型hela细胞的耗氧率接近(图6)。说明实施例3得到的完全线粒体转移液的效果最好。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12