本发明涉及水产养殖技术领域，尤其是涉及一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂。
背景技术：
曼氏无针乌贼（sepiellamaindroni）属于软体动物门mollusca、头足纲cephalopoda、二鳃亚纲dibranchia、乌贼目sepioidea、乌贼科sepiidae、无针乌贼属sepiella。曼氏无针乌贼的是一种高蛋白、低脂肪、营养较全面的海产品。它的经济价值很高，其可食用部分占总体的92%。它的肉质洁白，营养丰富，含有优质蛋白质和丰富微量元素，味道鲜美,经常食用可以聪明延智、延缓衰老、提高造血和免疫功能,对防止心血管疾病、贫血和肿瘤有一定的作用。但是随着对产卵群体的围捕以及张网作业对幼体乌贼的损害，捕捞强度的加大，使乌贼群体不能获得有效的补充，再加上自然环境的污染和破坏，从20世纪80年代末开始出现曼氏无针乌贼资源的急剧衰退，渔讯难再形成。曼氏无针乌贼是最近几年才得以规模化繁育及增养殖开发的重要头足类种类。但是乌贼的全人工繁育技术还存在许多问题，例如：由于内源性营养向外源性营养转变过程中初孵仔乌的成活率较低；初孵仔乌需要活体饵料，幼体和成体缺乏人工饵料；集约养殖条件下，养殖环境的调控等，所以目前养殖乌贼的经济成本仍较高。
随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。从某种意义上说，基因工程是现代生物技术的核心，而细胞工程是现代生物技术的基础和公用平台。细胞培养是开展细胞学基础研究、细胞结构与功能验证及细胞工程学研究必不可少的研究手段。海洋生物细胞培养研究由于起步较晚，同时海洋生物细胞培养条件因生活环境的巨大差异也与陆地生物差别较大，目前海洋生物细胞培养技术在很多种类上尚未成熟。但有关头足类乌贼体外条件下的细胞培养技术还未攻克，因而严重影响以细胞培养为基础的相关研究，因此迫切开发出一种稳定有效的细胞培养方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种分离所得的细胞数量较多，消毒彻底，减少分离时对胚胎的损伤，胚胎细胞贴壁生长量多、培养的成功率高、存活时间长的乌贼胚胎细胞的原代培养方法。
本发明的目的之二在于提供一种加快胚胎细胞的分裂，缩短细胞培养时间，能够刺激细胞自身更多地分泌生长因子，使得胚胎细胞在初期细胞贴壁期间表现更好，能快速从贴壁的组织块中开始迁移出来，继续生长的乌贼胚胎细胞的原代培养专有试剂。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为16-20℃、盐度为29-31、ph为7.0-8.0、光照度为4.1-13.1lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后50-70min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为22-24℃、盐度为29-31、ph为7.8-8.6的条件下培养2-3d，连续充氧，备用，早期胚胎卵黄占据了胚胎的绝大部分，分离后，离心收集到离心管中的多为卵黄和细胞的混合物，较难分离获得胚胎细胞，而受精2-3d的胚胎较容易进行原代细胞分离，分离所得的细胞数量也较多，成功率更高；
获取胚胎组织和细胞：将受精卵消毒，用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1000-1200r/min下离心3-5min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2-3μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在30-40℃下消化3-5min，以除去组织细胞间的细胞间质，使组织变得松散，分离成单个细胞或更小的细胞团块，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂，终止胰蛋白酶消化，在1000-1200r/min下离心3-5min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作，该处理方法能够保证卵在消毒和润洗过程中的完整性，减少对胚胎细胞的损伤，获得大小适宜且均匀的组织块，能随即除去卵膜，减小了卵膜以后对细胞生长的影响，提高细胞的贴壁效果，同时消毒彻底，使得胚胎细胞不能感染病菌，进而提高胚胎细胞培养的成功率；
胚胎细胞的原代培养：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理30-40枚受精卵，专有试剂用量为100-150μl，用parafilm封口膜包好，然后在20-30℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜专有试剂，并视细胞生长情况，每隔5-8d更换一次专有试剂，20-40d后即可得到乌贼细胞群，整个过程采用无菌操作，细胞的贴壁是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子的结合而实现的，培养板中的每个孔规定胚胎数量和培养基的体积，为的就是保证初期细胞贴壁期间能够获得足够的铺展空间以及由细胞自身分泌的贴壁因子和营养因子，才会有大量贴壁的细胞，并且随着以后培养基的不断补加细胞也才能更好地生长下去，更长时间地存活下去。
优选的，消毒方法为：依次用浓度为70-80%的乙醇溶液浸泡10-20min，ph为7.0-8.0的无菌pbs溶液冲洗4-6次，含0.62-0.72%的双抗生素和0.28-0.38%的氧氟沙星的无菌水浸泡20-40min，70-80%的乙醇溶液漂洗5-10s，ph为7.0-8.0的无菌pbs溶液洗涤冲洗4-6次。上述氧氟沙星中含有1.8-2.5%的右旋氧氟沙星，氧氟沙星通过抑制细菌dna旋转酶的活性，阻止细菌dna的合成和复制而导致细菌死亡，具有广谱抗菌作用，能够避免细菌对受精卵的影响，和双抗生素复配能够达到增益效果，大大提高了消毒作用，能够有效避免出现细胞被污染情况，而含有右旋氧氟沙星的氧氟沙星还能够穿过卵膜上的微孔，使得羰基化和硫基化的黏性物质失活，同时也能使卵膜内层解体，减弱卵膜和胚胎的粘黏性，使得卵膜更易于分离，减少分离时对胚胎的损伤，为提高胚胎细胞培养的成功率做准备。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、d-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。该专有试剂能够模拟胚胎细胞在体内生长的营养环境，能满足胚胎细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压和ph等诸多方法的需求，促进胚胎细胞的生长增殖，同时能够为胚胎细胞提供贴壁和扩展因子，使得大量细胞从贴壁的胚胎组织块中迁移出来并向四周延展扩散，很少有单个的细胞独立生长，同时能快速从贴壁的组织块中开始迁移出来，继续生长。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其制备方法为：
步骤1：将等体积的770-790mmnacl溶液、14-15mmkcl溶液、100-110mmmgcl2溶液和20-25mmcacl2溶液混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用，该培养基溶液可以维持胚胎细胞的渗透压、调节ph值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分；
步骤2：按重量体积比为1:75-85（mg/ml）将甲基纤维素加入培养基溶液中，在2-5℃下搅拌3-4h，得a溶液，备用；
步骤3：按重量体积比为1:7.5-8.5（mg/ml）将d-葡萄糖溶于培养基溶液中得b溶液，再将b溶液按照体积比为1:5加入a溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清和双抗生素，使得小牛血清终浓度为3-5%，乌贼血清终浓度为0.6-0.8%，双抗生素终浓度为0.8-1.2mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明原代培养方法分离所得的细胞数量较多，消毒彻底，能够减少分离时对胚胎的损伤，胚胎细胞贴壁生长量多、培养的成功率高、存活时间长；2）该培养方法在消毒的同时还能使消毒剂穿过卵膜上的微孔，使得羰基化和硫基化的黏性物质失活，同时也能使卵膜内层解体，减弱卵膜和胚胎的粘黏性，使得卵膜更易于分离，减少分离时对胚胎的损伤，为提高胚胎细胞培养的成功率做准备；3）本发明原代培养的专有试剂能够模拟胚胎细胞在体内生长的营养环境，满足胚胎细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压和ph等诸多方法的需求，促进胚胎细胞的生长增殖，同时能够为胚胎细胞提供贴壁和扩展因子，使得大量细胞从贴壁的胚胎组织块中迁移出来并向四周延展扩散。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
1）收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为16℃、盐度为31、ph为7.0、光照度为13.1lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后50min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为24℃、盐度为29、ph为8.6的条件下培养2d，连续充氧，备用；
2）获取胚胎组织和细胞：将受精卵消毒，用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1200r/min下离心3min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入3μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在30℃下消化5min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂，终止胰蛋白酶消化，在1200r/min下离心3min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作；
3）胚胎细胞的原代培养：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理30枚受精卵，专有试剂用量为100μl，用parafilm封口膜包好，然后在30℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜专有试剂，每隔5d更换一次专有试剂，40d后即可得到乌贼细胞群，整个过程采用无菌操作。
上述步骤1中消毒方法为：依次用浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min，ph为7.0的无菌pbs溶液冲洗6次，含0.62%的双抗生素和0.38%的氧氟沙星的无菌水浸泡20min，70%的乙醇溶液漂洗10s，ph为7.0的无菌pbs溶液洗涤冲洗6次。上述氧氟沙星中含有1.8%的右旋氧氟沙星。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、d-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其制备方法为：
步骤1：将等体积的770mmnacl溶液、15mmkcl溶液、100mmmgcl2溶液和25mmcacl2溶液混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用；
步骤2：按重量体积比为1:75（mg/ml）将甲基纤维素加入培养基溶液中，在5℃下搅拌3h，得a溶液，备用；
步骤3：按重量体积比为1:7.5（mg/ml）将d-葡萄糖溶于培养基溶液中得b溶液，再将b溶液按照体积比为1:5加入a溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清和双抗生素，使得小牛血清终浓度为5%，乌贼血清终浓度为0.6%，双抗生素终浓度为1.2mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂。
实施例2：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
1）收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为20℃、盐度为29、ph为8.0、光照度为4.1lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后70min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为22℃、盐度为31、ph为7.8的条件下培养3d，连续充氧，备用；
2）获取胚胎组织和细胞：将受精卵消毒，用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1000r/min下离心5min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在40℃下消化3min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂，终止胰蛋白酶消化，在1000r/min下离心5min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作；
3）胚胎细胞的原代培养：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理40枚受精卵，专有试剂用量为150μl，用parafilm封口膜包好，然后在20℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜专有试剂，每隔8d更换一次专有试剂，20d后即可得到乌贼细胞群，整个过程采用无菌操作。
上述步骤1中消毒方法为：依次用浓度为80%的乙醇溶液浸泡10min，ph为8.0的无菌pbs溶液冲洗4次，含0.72%的双抗生素和0.28%的氧氟沙星的无菌水浸泡40min，80%的乙醇溶液漂洗5s，ph为8.0的无菌pbs溶液洗涤冲洗4次。上述氧氟沙星中含有2.5%的右旋氧氟沙星。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、d-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其制备方法为：
步骤1：将等体积的790mmnacl溶液、14mmkcl溶液、110mmmgcl2溶液和20mmcacl2溶液混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用；
步骤2：按重量体积比为1:85（mg/ml）将甲基纤维素加入培养基溶液中，在2℃下搅拌4h，得a溶液，备用；
步骤3：按重量体积比为1:8.5（mg/ml）将d-葡萄糖溶于培养基溶液中得b溶液，再将b溶液按照体积比为1:5加入a溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清和双抗生素，使得小牛血清终浓度为3%，乌贼血清终浓度为0.8%，双抗生素终浓度为0.8mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂。
实施例3：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
1）收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为18℃、盐度为30、ph为7.5、光照度为8.5lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后60min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为23℃、盐度为30、ph为8.2的条件下培养2.5d，连续充氧，备用；
2）获取胚胎组织和细胞：将210枚受精卵依次用浓度为75%的乙醇溶液浸泡15min，ph为7.5的无菌pbs溶液冲洗5次，含0.67%的双抗生素和0.33%的氧氟沙星的无菌水浸泡30min，75%的乙醇溶液漂洗8s，ph为7.5的无菌pbs溶液洗涤冲洗5次，然后用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1100r/min下离心4min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2.5μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在35℃下消化4min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂，终止胰蛋白酶消化，在1100r/min下离心4min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作，上述氧氟沙星中含有2.2%的右旋氧氟沙星；
3）胚胎细胞的原代培养：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理35枚受精卵，专有试剂用量为120μl，用parafilm封口膜包好，然后在25℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜专有试剂，3天后在10倍物镜下每个视野平均可以观察到80个细胞团，每隔6d更换一次专有试剂，30d后在10倍物镜视野下可见大量的贴壁细胞，细胞团重叠现象较多，即为乌贼细胞群，整个过程采用无菌操作。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、d-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其制备方法为：
步骤1：将等体积的780mmnacl、14.2mmkcl、108mmmgcl2和21mmcacl2混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用；
步骤2：将5mg甲基纤维素加入400ml培养基溶液中，在4℃下搅拌3.5h，得a溶液，备用；
步骤3：将10mgd-葡萄糖溶于80ml培养基溶液中得b溶液，再将b加入a溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清和双抗生素，使得小牛血清终浓度为4%，乌贼血清终浓度为0.7%，双抗生素终浓度为1.0mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂。
实施例4：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
1）收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为18℃、盐度为30、ph为7.5、光照度为8.5lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后60min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为23℃、盐度为30、ph为8.2的条件下培养2.5d，连续充氧，备用；
2）获取胚胎组织和细胞：将210枚受精卵依次用浓度为75%的乙醇溶液浸泡15min，ph为7.5的无菌pbs溶液冲洗5次，含0.67%的双抗生素和0.33%的氧氟沙星的无菌水浸泡30min，75%的乙醇溶液漂洗8s，ph为7.5的无菌pbs溶液洗涤冲洗5次，然后用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1100r/min下离心4min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2.5μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在35℃下消化4min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的原代培养专有试剂，终止胰蛋白酶消化，在1100r/min下离心4min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作，上述氧氟沙星中含有2.2%的右旋氧氟沙星；
3）胚胎细胞的原代培养：用原代培养专有试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理35枚受精卵，专有试剂用量为120μl，用parafilm封口膜包好，然后在25℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜专有试剂，3天后在10倍物镜下每个视野平均可以观察到84个细胞团，每隔6d更换一次专有试剂，30d后在10倍物镜视野下可见大量的贴壁细胞，细胞团重叠现象较多，即为乌贼细胞群，整个过程采用无菌操作。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，具体包括以下组分：培养基溶液、甲基纤维素、d-葡萄糖、小牛血清、乌贼血清、双抗生素。
一种乌贼胚胎细胞的原代培养的专有试剂，其制备方法为：
步骤1：将等体积的780mmnacl、14.2mmkcl、108mmmgcl2和21mmcacl2混合均匀，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得培养基溶液，备用；
步骤2：将5mg甲基纤维素加入400ml培养基溶液中，在4℃下搅拌3.5h，得a溶液，备用；
步骤3：将10mgd-葡萄糖溶于80ml培养基溶液中得b溶液，再将b加入a溶液中，然后再加入小牛血清、乌贼血清、安西他滨和双抗生素，使得小牛血清终浓度为4%，乌贼血清终浓度为0.7%，安西他滨终浓度为0.24mg/100ml，双抗生素终浓度为1.0mg/100ml，混合均匀，即得专有试剂，安西他滨不仅可以加快胚胎细胞的分裂，缩短细胞培养时间，同时能够刺激细胞自身更多地分泌生长因子，且作用时间较长，提高细胞分裂和生长，也具有一定的维持细胞初始形态的作用，提高细胞代数。
实施例5：
一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法，包括收集受精卵、获取胚胎组织和细胞、胚胎细胞的原代培养，具体包括如下步骤：
1）收集受精卵：选择健康乌贼亲体，按雌雄比1:1分别暂养于水泥池内，充气、遮光，将乌贼产卵基放入池内收集受精卵，在海水温度为18℃、盐度为30、ph为7.5、光照度为8.5lx的条件下培养，在产卵开始至产卵后60min内将受精卵取出，置于玻璃水槽中孵化，在海水温度为23℃、盐度为30、ph为8.2的条件下培养2.5d，连续充氧，备用；
2）获取胚胎组织和细胞：将210枚受精卵依次用浓度为75%的乙醇溶液浸泡15min，ph为7.5的无菌pbs溶液冲洗5次，含0.67%的双抗生素和0.33%的氧氟沙星的无菌水浸泡30min，75%的乙醇溶液漂洗8s，ph为7.5的无菌pbs溶液洗涤冲洗5次，然后用镊子将卵膜撕裂，释放出胚胎和卵黄，在超净工作台内将胚胎移至培养皿中，剪碎，在1100r/min下离心4min，获得胚胎组织沉淀，沉淀中加入2.5μg/ml的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，在35℃下消化4min，再加入与胰蛋白酶溶液等体积的常用培养试剂，终止胰蛋白酶消化，在1100r/min下离心4min，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀，整个过程采用无菌操作，上述氧氟沙星中含有2.2%的右旋氧氟沙星；
3）胚胎细胞的原代培养：用常用培养试剂悬浮胚胎组织和细胞沉淀，转移到培养板中，每个孔处理35枚受精卵，常用培养试剂用量为120μl，用parafilm封口膜包好，然后在25℃的恒温培养箱中培养，第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜常用培养试剂，3天后在10倍物镜下每个视野平均可以观察到48个细胞团，每隔6d更换一次专常用培养试剂，30d后在10倍物镜视野下可见大量的贴壁细胞，但细胞团重叠的情较少，说明实施例3用专有试剂的培养效果远远好于常用培养试剂。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。