一种脐血调节性T细胞体外扩增方法与流程

本发明涉及调节性t细胞的体外扩增方法，尤其涉及一种脐血调节性t细胞体外扩增方法。

背景技术：

cd4⁺cd25⁺foxp3⁺调节性t细胞（regulatorytcells,tregs）是一种t细胞亚群，可以通过多种方式抑制免疫反应，包括分泌抑制性细胞因子il-10、tgf-β等；大量消耗维持炎症细胞生存的细胞因子il-2；细胞表面的接触抑制。

当体内tregs缺乏或者细胞功能缺失后，机体会产生自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎（ra），重症肌无力（mg），多发性硬化症（ms），糖尿病，系统性红斑狼疮（sle）等。tregs尤其抗原特异性的tregs在治疗自身免疫性疾病疾病中具有良好的发展前景。anderton与bykovskaya等体外扩增sle病人外周血来源的cd4⁺cd25⁺foxp3⁺cd127^lowtregs后，输注至病人体内后，发现病人体内的tregs数目增长1.5-2倍，并未出现副作用，且降低了病人疾病复发率，有效弥补了病人外周血中tregs细胞的功能。体外通过树突状细胞（dendriticcells,dc）刺激产生胰岛特异的cd4⁺cd25⁺cd62l⁺tregs细胞能够恢复非肥胖糖尿病小鼠的血糖水平。向i型糖尿病（t1d）患者体内输注体外扩增的自体cd4⁺cd25⁺cd127^lowtregs后，2年内个别患者体内c肽水平能够维持正常水平，且不产生任何副作用。

脐血（umbilicalcordblood，ucb）中cd4⁺cd25⁺tregs细胞是独立细胞群，是一组比较单纯的细胞，主要为cd4⁺cd25^hightregs细胞,cd4⁺cd25^lowtregs细胞数量较少，脐血的大部分tregs主要是cd45ra⁺，cd45ro⁺较少，这说明脐血中的tregs细胞主要为初始细胞，而不是活化的细胞，原因可能与胎儿处于相对没有抗原刺激的环境下，导致了脐血中效应t细胞数量较少；脐血中cd4⁺cd25⁺tregs细胞的数量明显高于成人外周血（0.35%-9.07%比1.64%-6.45%）。研究发现脐血中新鲜分离的cd4⁺cd25⁺tregs细胞较成人外周血中分离的cd4⁺cd25⁺tregs细胞的抑制活性弱，然而研究发现体外经cd3，cd28单克隆抗体联合il-2刺激培养的脐血cd4⁺cd25⁺tregs细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能，且体外扩增获得的脐血tregs细胞在体内存活率高，这意味着ucb来源tregs细胞较外周血来源tregs细胞临床应用价值更高。传统tregs细胞体外扩增多使用磁珠分选获得纯度较高的tregs细胞后，添加il-2，il-15，il-33等细胞因子，并添加anti-cd3/cd28磁珠刺激增殖。虽然tregs体外扩增倍数较高，但是传统tregs体外扩增方法成本较高，且生物安全性有待考究。因此，建立成本低、生物安全性的treg细胞体外扩增方法，才能满足大量的临床输注需要。

技术实现要素：

本发明是针对现有技术的不足，本发明公开了一种脐血调节性t细胞体外扩增方法，通过直接获得脐血的单个核细胞，并将其铺于anti-cd3抗体包被的培养皿中培养，并添加cd28抗体，il-2及tgf-β，诱导tregs细胞的扩增，该方法不添加免疫磁珠。

为了实现上述目的，采取的技术方案是：

一种脐血调节性t细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

（1）细胞分离：新鲜脐血与pbs缓冲液1:1混合，缓慢加入等体积ficoll淋巴细胞分离液中，密度梯度离心；收集单个核细胞白膜层，离心，弃上清液，获得脐血单个核细胞沉淀，细胞沉淀用pbs缓冲液重悬，离心，弃上清液，获得脐血单个核细胞；

（2）细胞培养：将步骤（1）制得的单个核细胞和细胞培养液混合，得到细胞悬液，接种至anti-cd3抗体包被的增殖培养皿中，添加tregs细胞增殖培养液诱导培养；

（3）细胞扩增培养：培养至第6天，将细胞转移至不包被anti-cd3抗体的培养皿中，休整培养至第8天，将细胞再次转移至anti-cd3抗体包被的tregs细胞增殖培养皿中，体外扩增培养第14天，收取扩增后的细胞。

优选地，步骤（2）中脐血单个核细胞接种密度为0.5-1×10⁸/100mm培养皿。

优选地，步骤（2）、（3）中tregs细胞增殖培养液为gibcorpmi1640培养液添加10%fbs、2000iu/mlil-2、100ng/mlanti-cd28抗体、5ng/mltgf-β，培养时每三天更换一次培养液。

优选地，步骤（3）休整时，细胞培养液为gibcorpmi1640培养液添加10%fbs，2000iu/mlil-2。

优选地，步骤（2）、（3）培养的条件为37℃、5%co2及饱和湿度。

优选地，步骤（3）所述的细胞扩增后数量为起始细胞的1000-3000倍。

附图说明

图1是扩增第0天，第6天及第14天扩增细胞的生长状态图。

图2是扩增第0天，第6天及第14天流式细胞仪检测的扩增获得的细胞中tregs细胞的表型图。

图3是体外扩增获得的tregs细胞抑制第三方无关供者外周血效应t细胞的增殖示意图。

本发明的有益效果：

1.扩增tregs方法高效、简便，可以利用丰富的新鲜脐血资源；

2.不经过磁珠分选，且扩增过程中不添加磁珠，保证生物安全性，降低体外扩增成本；

3.本发明方法培养获得的细胞中tregs细胞的扩增倍数高，且获得的细胞中tregs细胞的纯度高，扩增后获得的细胞中cd4⁺cd25⁺t细胞比例可上升至92%左右，其中foxp3⁺t细胞高达88%。

4.体外扩增获得的tregs细胞在tregs：效应t细胞比例为1:1、1:2、1:5时均能有效抑制效应t细胞的体外扩增。

具体实施方式：

本发明所提供的体外扩增脐血来源的调节性t细胞的方法中所使用的试剂及仪器均可由市场所购得。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明：

实施例1新鲜脐血来源的tregs细胞的体外扩增与培养

用5μg/ml纯化的anti-cd3抗体溶液包被培养皿：使用pbs缓冲液稀释纯化的anti-cd3抗体至5μg/ml，向100mm培养皿添加6ml配置的5μg/ml抗anti-cd3抗体溶液，37℃培养箱静置4h，吸弃抗体。使用pbs缓冲液漂洗培养皿一次，操作台中风干培养皿底部。

脐血取自足月健康新生儿的脐带，加入枸橼酸钠抗凝，采集后24小时之内进行分离。

脐血使用pbs按1:1比例稀释，缓慢加入等体积ficoll淋巴细胞分离液中，2000rpm，离心20min，升速1，降速1。收集单个核细胞白膜层至新的50ml离心管中，1000rpm，离心5min，升速9，降速9，弃上清，获得脐血单个核细胞沉淀。

脐血单个核细胞沉淀使用pbs缓冲液重悬后，1000rpm，离心5min，升速9，降速9，弃上清，共两次。最终获得单个核mncs，使用gibcorpmi1640培养液添加10%fbs，2000iu/mlil-2，100ng/mlanti-cd28抗体及5ng/mltgf-β重悬mncs后，0.5-1×10⁸细胞铺至包被anti-cd3抗体的100mm培养皿中。细胞置于与37℃、5%co2及饱和湿度的条件下培养，共6天，每3天全换液一次。经过培养，细胞逐渐聚集成团，呈现集落样生长（如图1）。

培养第6天，收取细胞，使用gibcorpmi1640培养液添加10%fbs，2000iu/mlil-2重悬后，细胞铺至未包被anti-cd3抗体的100mm培养皿中，休整培养2天。

培养第8天，收取细胞，使用gibcorpmi1640培养液添加10%fbs，2000iu/mlil-2，100ng/mlanti-cd28抗体及5ng/mltgf-β重悬后，细胞铺至2个包被anti-cd3抗体的100mm培养皿中。细胞置于与37℃、5%co2及饱和湿度的条件下培养，共6天，每3天全换液一次。

培养至第14天后，组成集落的细胞数增多，细胞呈现堆积样（如图1），收取扩增后的细胞。

实施案例2新鲜脐血体外扩增获得的细胞表面抗原流式检测

收取扩增后的细胞，使用pbs缓冲液重悬，计数。取部分细胞过100目细胞筛网，离心，收集细胞沉淀，使用pbs缓冲液重悬沉淀，调整为1×10⁶细胞/ml。每管加入200μl细胞悬液，并加入5μl流式细胞抗体，使用fitc标记的anti-cd4抗体、pe标记的anti-cd25抗体室温进行细胞表面抗原标记30min，细胞经过破膜液及固定液处理1h之后，用alexa488标记的anti-foxp3抗体进行细胞内抗原标记30min。结果如图2显示，与起初新鲜脐血mnc中cd4⁺cd25⁺t细胞比例仅为0.19%相比（图2，0day），扩增后获得的细胞中cd4⁺cd25⁺t细胞比例上升至91.75%，其中foxp3⁺t细胞高达88.26%（图2，14day）。

实施例3扩增获得细胞抑制效应细胞增殖功能检测

使用ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离获得成人外周血中单个核细胞，免疫磁珠分离纯化得到的cd4⁺cd25^-细胞作为效应t细胞，使用cfse（5μm）染色后，以1×10⁵细胞/孔接种于anti-cd3抗体包被的96孔板中，按照tregs：效应t细胞=0:1、1:1、1:2，1:5比例，向96孔板中加入扩增后的新鲜脐血tregs细胞，每孔添加gibcorpmi1640+10%fbs+2000iu/mlil-2+100ng/mlanti-cd28培养液，于37℃、5%及饱和湿度条件下培养4天，4天后收集96孔板中细胞，并使用流式细胞仪进行结果分析。如图3所示，体外扩增获得的tregs细胞在tregs：效应t细胞比例为1:1，1:2，1:5时均能有效抑制效应t细胞的体外扩增。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。