一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法。

背景技术：

肝脏是人体最大的解毒工厂，肝脏通过细胞色素酶p450（cyp）家族代谢化学物质，通过氧化、还原、或水解反应，使这些化学物质绝大多会失去原有活性。正由于肝脏的解毒功能，药物是肝损害的重要病因之一。药物引起肝病的机制因药而异，非常复杂，大多数情况下尚不清楚。有些药物具有直接的毒性作用，损害与药物剂量有关；另一些药物仅偶尔在敏感的个体引起肝损伤，而且与剂量无关。因此，药物开发过程中，肝脏毒性测试尤为重要。虽然在预测新药对人体的毒性的时候动物常常是不错的模型，但是物种差异导致的代谢差异也是无法忽略的。此外，尽量减少实验动物的使用数量也是监管部门和动物福利部门的一致以来在努力践行的，通过细胞水平的体外初筛可以大大降低成本并提高药物筛选效率。

尽管肝脏是人类大器官中唯一可再生的器官，切除掉2/3的肝叶在数周时间内仍可以再生为一个和原来大小类似的完整肝脏。然而，肝脏细胞分离出来后在培养皿中却无法扩增和传代，在1-2周的时间内即去分化，失去解毒功能。因此，在体外毒性测试中，原代肝细胞是最好的候选，但来源严重不足和使用时间窗口也很短。因此，寻求其他方法获取肝脏细胞尤为重要。

近年来开始有不少研究开始探索使用人多能干细胞（hpsc），包括人胚胎干细胞（hesc）或人诱导多能干细胞（hipsc）分化为肝脏细胞（iheps）。这种技术的优势在于hesc和hipsc可以无限扩增，通过定向分化，可以带来取之不竭的肝脏细胞。而hipsc经过10年的蓬勃发展，全球已建立了多组织来源，包含有多种疾病突变基因型，以及多株经过基因修饰后细胞系。这不但可以为我们提供用于毒性测试的肝脏细胞，也大大丰富了我们在进行肝脏疾病模型构建时的体外模型资源。

肝样细胞能表达人原代肝细胞的标志物，如人血白蛋白（alb），a1-抗胰蛋白酶（aat），人去唾液酸糖蛋白受体（asgpr），但是用于解毒功能的细胞色素酶仍不成熟，其功能有限；将iheps移植入免疫缺陷小鼠，和原代肝脏细胞相比，其整合率仍然较低，人血清白蛋白表达的水平也较低。这些特性限制了iheps在多个领域的应用。因此，如何获得成熟的多能干细胞来源的肝脏细胞具有重大现实意义。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明公开了一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，通过fah敲除的免疫缺陷动物体内传代的方法，同时添加细胞因子，促进人多能干细胞来源的肝脏细胞成熟，使之可以在动物体内扩增及快速增殖。同时，使从动物肝脏分离下来的人肝脏细胞更加成熟，可以用于新药毒性测试及构建人工肝脏。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的获取方法，其包括以下步骤：

步骤s1，定向分化人多能干细胞hpscs到肝脏细胞iheps；

步骤s2，移植肝脏细胞iheps至动物体内，使肝脏细胞iheps在动物体内扩增及增殖，并促进其成熟，

步骤s3，将肝脏细胞iheps在动物体内进行次第传代。

其中，动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、猴子。优选的，所述动物体为小鼠或新西兰大白兔。

作为本发明的进一步改进，步骤s2中，移植肝脏细胞iheps至动物体中之前，先对动物注射编码尿激酶（upa）的腺病毒。

作为本发明的进一步改进，步骤s2中，移植肝脏细胞iheps至动物体时，添加细胞生长因子及间充质干细胞，提高iheps在动物肝脏内的嵌合率，促进iheps成熟。

作为本发明的进一步改进，步骤s2，包括以下子步骤：

步骤s201，用pbs清洗培养皿中的iheps两次，然后每孔加入tryple和dnasei；

步骤s202，显微镜下观察细胞形态，当超过50%的细胞变圆时，使用等体积的rpmi1640+20%ksr吹下iheps，收集到离心管中；重复上述步骤直至将所有的细胞都收集至离心管中，进行离心；

步骤s203，去除上清，使用pbs重悬细胞；补加pbs，用40µm孔径细胞筛过滤细胞，移除细胞团块；

步骤s204，依据100万-150万iheps/25g动物的标准取出需要的细胞量，离心去上清；

步骤s205，复苏人脐带来源的间充质干细胞，计数，按照与iheps的活细胞数目比例1:3~1:6混合，得到细胞混合液；

步骤s206，使用pbs、100ng-100ug/mlhgf、0.1-100um氢化可的松的混合液重悬上述细胞混合液，使得细胞浓度为4-6千万/ml，然后与细胞悬液等体积的matrigel混合，使得细胞浓度为2-3千万细胞/ml；使用预冷的黄色枪头轻轻吹打均匀；

步骤s207，将胰岛素注射器置于冰上，吸取55µl细胞悬液注入注射器中，并将注射器腔体中的空气挤出；将注射器放入冰上待用；

将注射器腔体中的空气挤出可以采用以下步骤：注射器的针头向上甩一下注射器，使得细胞在注射器橡胶头处聚集，然后轻轻推动活塞，将注射器腔体中的空气挤出。

步骤s208，使用脾脏注射的方法，将细胞悬液注射入动物脾脏，在随后的几日内，细胞会迁移入肝脏。通过免疫组化和动物血浆elisa(bethyllaboratories)可以检测到人源肝脏细胞整合入动物肝脏，同时，动物血浆中存在人源血清白蛋白。

作为本发明的进一步改进，步骤s202和步骤s205中，离心时，使用4℃离心机以200g离心3分钟。

作为本发明的进一步改进，其中步骤s1包括以下子步骤：

步骤s101，将hpscs种到matrigel包被的六孔板上，培养基为mtesr1，添加5um的rock抑制剂；培养箱条件设定为37℃、5%co2，保持湿润；24小时和48小时后分别使用新鲜的mtesr1换液；

步骤s102，72小时后开始分化，设定时间为day0，使用rpmi1640清洗一次细胞，然后添加含有rpmi1640+100ng/mlactivina+25ng/mlwnt3a的培养基开始诱导；

步骤s103，day1和day2分别使用含有rpmi1640+100ng/mlactivina的培养基换液；

步骤s104，day3，使用knockoutdmem清洗贴壁细胞一次，使用ksr/dmso培养基培养；此后使用同样的培养基每2天换液一次，直至day10；

步骤s105，day10，添加hepatocytebasalmedium，然后加入hepatocyteculturemedium、20ng/mlhumanhepaticgrowthfactor、20ng/mloncostatinm促进iheps成熟；此后每两天使用同样培养基换液一次。

作为本发明的进一步改进，day15-day17，将细胞通过脾脏移植入动物肝脏内。

作为本发明的进一步改进，所述ksr/dmso培养基的成分为20%knockoutserumreplacement+1xneaa+1xglutamax+0.1mmbeta-mercaptoethanol+1%dmsoinknockoutdmemmedium。

作为本发明的进一步改进，步骤s3包括以下子步骤：取第一轮移植动物血浆人血白蛋白水平最高的动物，使用胶原酶肝脏灌注，获得单细胞悬液后，使用动物细胞去除试剂盒去除动物细胞，再次移植动物进行第二轮穿代，然后同样的方法移植第三轮。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，通过fah敲除的免疫缺陷动物体内传代的方法，同时添加细胞因子，促进人多能干细胞来源的肝脏细胞成熟，使之可以在动物体内扩增及快速增殖；通过分离出动物肝脏内的人源肝脏细胞，添加细胞生长因子及间充质干细胞的方法，促进iheps的进一步成熟，然后通过第次体内传代的方法最终获得和人原代肝细胞整合率近似得iheps；该方法简便易行，3轮传代后获得的iheps可以作为种子细胞，在动物体内保存或冻存，获得可无限扩增的且成熟的iheps。

附图说明

图1是本发明实施例定向分化人多能干细胞hpscs到肝脏细胞iheps的分化方案及鉴定图。

图2是本发明实施例检测小鼠肝脏中和血浆中（b）的人血清白蛋白（humanalbumin）表达图。其中，图a）为通过免疫组化检测小鼠肝脏中和血浆中（b）的人血清白蛋白表达图，图b，c）为通过elisa检测不同移植条件下小鼠肝脏中和血浆中（b）的人血清白蛋白表达图。

图3是本发明实施例iheps在frg（fah^-/-rag2^-/-il2rg^-/-）小鼠中次第传代示意图，其中，方框中流程为次第传代。

图4是本发明实施例通过elisa鉴定的三轮次第传代过程中小鼠血浆人血白蛋白水平。其中，图a为第一轮，图b为第二轮，图c为第三轮。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

一种成熟的多能干细胞来源肝脏细胞的培养方法，其包括以下步骤：

步骤s1：定向分化人多能干细胞（hpscs）到肝脏细胞（iheps）；具体包括以下步骤：

（1）以300,000细胞每孔的密度将hpscs种到matrigel（corning）包被的六孔板上，培养基为mtesr1（stemcelltechnologies）添加5um的rock抑制剂（y27632，sigma-aldrich）。培养箱条件设定为37℃，5%co2，保持湿润。

（2）24小时和48小时后分别使用新鲜的mtesr1换液。

（3）72小时后开始分化，设定时间为day0.使用rpmi1640清洗一次细胞，然后添加rpmi1640（thermofisher）+100ng/mlactivina（peprotech）+25ng/mlwnt3a（r&d）培养基开始诱导。

（4）day1和day2分别使用rpmi1640+100ng/mlactivina培养基换液

（5）day3,使用knockoutdmem（thermofisher）清洗贴壁细胞一次，使用ksr/dmso培养基(20%knockoutserumreplacement+1xneaa+1xglutamax+0.1mmbeta-mercaptoethanol+1%dmsoinknockoutdmemmedium)培养.此后使用同样培养基每2天换液一次，直至day10.（本步骤中试剂除dmso来自于sigma-aldrich外，其他均来自于thermofisher）

（6）day10,使用hepatocytebasalmedium（lonza），然后使用hepatocyteculturemedium（lonza）+20ng/mlhumanhepaticgrowthfactor（hgf,peprotech）+20ng/mloncostatinm（peprotech）促进iheps成熟.此后每两天使用同样培养基换液一次.

（7）day15-17,细胞即可以通过脾脏移植入小鼠肝脏.

（8）留取部分孔进行鉴定，光镜下day15-day17iheps应呈现肝细胞特有的多边形结构，部分细胞可见双细胞核；大部分细胞为hnf4a，alb，aat，asgpr阳性，pas染色阳性，油红（oil-redo）染色阳性，如图1所示。

步骤s2：移植iheps至frg小鼠，包括以下子步骤：

移植前24小时，每只小鼠按照1.25x10⁹pfu/25g小鼠的剂量注射编码尿激酶（upa）的腺病毒。

（1）使用不含钙镁离子的pbs（hyclone）清洗iheps两次，每次2ml/孔,然后每孔加入1mltryple/dnasei(thermofisher/roche)混合液.将培养皿放回培养箱消化8-10分钟.

（2）8分钟后，显微镜下观察细胞形态，当大部分细胞变圆时，使用等体积的冷的rpmi1640+20%ksr轻轻吹下iheps，然后收集到15ml离心管中。

（3）重复上述步骤直至将所有的细胞都收集至15ml离心管中。

（4）使用4℃离心机以200g离心3分钟。

（5）去除上清，使用2ml冷的pbs重悬细胞.补加冷的pbs，使得细胞终体积（ml）等于细胞来源的6孔板的孔数。最后，使用40µm孔径细胞筛(bd)过滤细胞，移除细胞团块。

（6）计数。依据100万-150万iheps/鼠的标准取出需要的细胞量。4℃离心机以200g离心3分钟，去上清。

（7）复苏人脐带来源的间充质干细胞，计数，按照1:6-1:3（活细胞数目比例）和iheps混合。

（8）使用冷的pbs+hgf(100ng-100ug/ml)+氢化可的松（0.1-100um）重悬上述细胞混合液，使得细胞浓度为4-6千万/ml，然后与细胞悬液等体积的matrigel混合，使得细胞浓度为2-3千万细胞/ml.使用预冷的黄色枪头轻轻吹打均匀。

（9）将预冷的胰岛素注射器(bd)置于冰上,取下活塞，使用预冷的黄色枪头吸取55µl细胞悬液注入注射器，然后放回活塞，针头向上轻轻甩一下注射器，使得细胞在注射器橡胶头处聚集.然后轻轻推动活塞，将注射器腔体中的空气挤出。

（10）将注射器放入冰上待用。同样方法，将所有的细胞分装入注射器

（11）使用脾脏注射的方法，将细胞悬液注射入小鼠脾脏，在随后的几日内，细胞会迁移入肝脏。通过免疫组化和小鼠血浆elisa(bethyllaboratories)可以检测到人源肝脏细胞整合入小鼠肝脏，同时，小鼠血浆中存在人源血清白蛋白，如图2所示。

步骤s3：将iheps从frg小鼠中第次传代，示意图如图3所示，具体为：

取第一轮移植小鼠血浆人血白蛋白水平最高的小鼠，使用胶原酶（yecuris）肝脏灌注，获得单细胞悬液后，使用mousecelldepletionkit去除小鼠细胞，再次移植frg小鼠（第二轮）。然后同样的方法移植第三轮。三轮之后即可获得和人原代肝脏细胞类似的整合率，如图4所示。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。