本发明涉及生物细胞培养技术领域，具体涉及一种用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒及使用方法。
背景技术：
各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，目前的工具鼠多为小鼠背景，而心肌细胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌细胞，相较于大鼠心肌原代细胞的分离纯化技术及比较成熟的h9c2细胞系体系，小鼠心肌原代细胞的分离纯化明显不足。目前心肌原代细胞分离方法多采用胰酶胶原酶联合消化或单一胶原酶消化，心肌细胞纯化多采用差速贴壁法。
采用胰酶胶原酶联合消化的缺陷是：胰酶对心肌细胞有一定的损伤极大地影响了心肌细胞的存活率，当前虽极力减少细胞与胰酶的接触时间及减少胰酶的消化时间，但对心肌细胞存活率的影响依然存在，这在小鼠心肌原代分离纯化过程中尤为明显。
采用单一胶原酶消化的缺陷是：虽然胶原酶作用较缓和，对细胞损伤较小，但后期需用化学抑制剂(如5-溴脱氧尿嘧啶)抑制成纤维细胞生长以期纯化心肌。在小鼠心肌原代细胞培养中依然存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷，且化学抑制剂的存在是否影响心肌细胞的功能，尚有待证明，且化学抑制剂的存在将增加实验本身的影响因素，使结果出现难以预计的偏倚。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒及使用方法，保证了心肌细胞的活性，细胞存活率更高。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒，所述试剂盒包括心肌缓冲粉末，所述心肌缓冲粉末包括7.012-8.007份nacl，0.395-0.403份kcl，0.123-0.222份mgso4.7h2o，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份kh2po4，0.042-0.071份na2hpo4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
在上述技术方案的基础上，所述心肌缓冲粉末用超纯水定容，用naoh调整ph至7.5。
本发明还公开了一种所述的用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒的使用方法，所述心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液可用于漂洗剪下的心脏组织。
在上述技术方案的基础上，所述心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液可用于配制用于消化心脏组织的ⅱ型胶原酶溶液。
在上述技术方案的基础上，使用ⅱ型胶原酶溶液消化心脏组织后，过滤，离心，用所述心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液进行细胞重悬。
在上述技术方案的基础上，取0.05gⅱ型胶原酶，用心肌缓冲粉末定容至100ml，制成0.05％ⅱ型胶原酶溶液；取0.1gⅱ型胶原酶，用心肌缓冲粉末定容至100ml，制成0.1％ⅱ型胶原酶溶液。
在上述技术方案的基础上，使用ⅱ型胶原酶溶液消化心脏组织包括：
将0.05％ⅱ型胶原酶加入离心管中，摇床培养，弃上清；
将0.1％ⅱ型胶原酶加入离心管中，摇床培养，取上清放入血清中混匀。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
采用本发明的试剂盒进中心肌缓冲粉末为低钙粉末，不含有胰酶或添加化学抑制剂，避免了胰酶化学抑制剂对心肌细胞的损伤，适宜于保持心肌细胞活性，因此，采用本发明的试剂盒可最大程度上保证了心肌细胞的活性，细胞存活率更高。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作进一步详细说明。
本发明实施例提供一种用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒：试剂盒包括心肌缓冲粉末，心肌缓冲粉末包括7.012-8.007份nacl，0.395-0.403份kcl，0.123-0.222份mgso4.7h2o，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份kh2po4，0.042-0.071份na2hpo4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。心肌缓冲粉末用超纯水定容，用naoh调整ph至7.5。
本发明实施例还公开了一种用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒的使用方法：
心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液可用于漂洗剪下的心脏组织。心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液可用于配制用于消化心脏组织的ⅱ型胶原酶溶液。使用ⅱ型胶原酶溶液消化心脏组织后，过滤，离心，用心肌缓冲粉末配制的心肌缓冲液进行细胞重悬。
取0.05gⅱ型胶原酶，用心肌缓冲粉末定容至100ml，制成0.05％ⅱ型胶原酶溶液；取0.1gⅱ型胶原酶，用心肌缓冲粉末定容至100ml，制成0.1％ⅱ型胶原酶溶液。
使用ⅱ型胶原酶溶液消化心脏组织包括：
1)将0.05％ⅱ型胶原酶加入离心管中，摇床培养，弃上清；
2)将0.1％ⅱ型胶原酶加入离心管中，摇床培养，取上清放入血清中混匀。
采用本发明的试剂盒进中缓冲液为低钙试剂，不含有胰酶或添加化学抑制剂，避免了胰酶化学抑制剂对心肌细胞的损伤，适宜于保持心肌细胞活性，因此，采用本发明的试剂盒可最大程度上保证了心肌细胞的活性，细胞存活率更高。
实施例1：采用用于心肌细胞分离提纯的心肌缓冲液试剂盒的分离进行心肌细胞分离提纯的过程
a：准备：
1)、75％酒精于50ml离心管中，眼科剪、弯眼科镊等器械高压灭菌置于上述离心管中20min，放于培养皿中自然风干；40只出生3天以内的乳鼠；0.05％ⅱ型胶原酶15ml、0.1％ⅱ型胶原酶100ml；10％胎牛血清(不含青链霉素)100ml；胎牛血清12ml；包被液100ml；培养皿三个；六孔板、15ml离心管若干；
2)、工作台放纱布；
3)、将心肌细胞培养基37℃水浴。
b：包被：
将配好的浓度为1％-1.5％的包被液加入培养皿中，37℃孵育1-2小时，种细胞前pbs清洗3次。
加入包被液体积为：
12孔板0.5ml/孔；
6孔板1ml/孔；
培养皿1/3ml/cm；
c:取心脏
1)、弯镊镊起乳鼠，75％酒精消毒皮肤；
2)、在心尖处剪开肋骨，手指轻轻收紧背部皮肤，使心脏从伤口蹦出；
3)、使用心肌缓冲粉末配制心肌缓冲液。用剪刀迅速将心脏剪下，放入装有预冷心肌缓冲液的培养皿中；
4)、重复上述步骤分离全部心脏，将心脏拿起，剪去上部的心房部分，注意不要撕掉太多以免浪费，去掉心房以后将心脏放入装有预冷心肌缓冲液的培养皿中漂洗，洗去心脏残留的淤血；
5)、将漂洗干净的心脏组织剪碎成1mm3的组织块，将剪碎的心脏组织移入离心管中，静置于冰上，弃上清；
d：消化
1)、预消化：将7ml0.05％ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，37℃侧摆摇床上缓慢摇动培养15min，弃上清；
2)、消化：将7ml0.1％ⅱ型胶原酶加入预消化心脏组织的离心管中，37℃侧摆摇床上缓慢摇动培养15min，取上清，放入装有2ml血清的离心管中混匀，重复消化3-4次；
3)、上清混匀后过滤，离心，800rpm，4℃5min，离心后用5ml心肌缓冲液重悬，细胞悬液加入15ml离心管中。
4)配制密度梯度液：将4ml高密度液悬空滴加入15ml离心管中，再轻柔缓慢贴壁加入5ml低密度液，勿使液面震动。
密度梯度液由高密度液和低密度液配制而成，高密度液包括超纯水、percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；低密度液包括超纯水、percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；按质量份计，缓冲液包括35.064-40.032份nacl，1.975-2.013份kcl，0.615-1.107份mgso4.7h2o，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份kh2po4，0.213-0.365份na2hpo4，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
5)、纯化：将5ml细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，3000rpm,4℃离心35min，可见液面分为三层，最上层为非心肌细胞层，包括心肌成纤维细胞及杂质，中间层为心肌细胞，最底层为红细胞；
6)、先吸出最上层，后吸出中间层即心肌层，将吸出的中间层置于离心管中，800rpm，4℃离心5min，沉淀即为纯化的原代心肌细胞，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清重悬心肌细胞，计数后将细胞按0.5-1×106/ml种植于包被好的六孔板中，37℃、5％co2温箱中培养。
此全过程历时仅2-2.5h，极大的提高了心肌分离纯化的效率，且3-4h后即可观测到心肌跳动，纯度及心肌存活率均在95％以上。
本发明不仅局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本发明相同或相近似的技术方案，均在其保护范围之内。