一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液。

背景技术：

293t细胞是由293细胞派生并表达sv40大t抗原的人肾上皮细胞系，是包装病毒的主要细胞。随着细胞治疗和基因治疗技术的快速发展，尤其在car-t疗法药物成功上市以来，293t无血清悬浮培养的产业化和规模化更为迫切。

尽管atcc将293t细胞进行了商业化处理后得到比较稳定的细胞系，但在实际生产过程中，由于293t细胞的用量较大且传代次数过多，细胞的生物学特性就会发生改变，影响病毒的包装效率。目前293t细胞的常规培养方法多采用贴壁并添加血清进行培养，贴壁培养导致培养效率低，空间利用率低，仪器、耗材、人工等成本的增加；而血清成分复杂，批次间差异较大，血清质量的检定较为复杂，用此细胞生产的病毒质量难以控制，并且增加产品的检测项目，耗费大量的人力物力。而目前市售的悬浮无血清培养基，多存在悬浮驯化效率低、细胞增殖慢、细胞特性不稳定、价格昂贵等问题。针对这一问题，迫切需要结合中国2015版《中国药典》和《药品生产质量管理规范》等政策要求，设计一套无血清悬浮培养293t细胞培养液，以提高细胞增殖效率、保持细胞特性、增强病毒包装效率、降低商品成本及价格。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液。

本发明所述用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液，该培养液不含血清成分，是以市售dmem-f12培养基为基液添加l-丙氨酰-l谷氨酰胺、维生素c、hepes、类胰岛素生长因子(igf-1)、表皮生长因子(egf)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、pluronicf-68制成；其特征在于：所述培养液中的dmem-f12培养基为不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养基，其中含有500～1500mg/ll-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.1～1mg/l维生素c、2383～11915mg/lhepes、5～200μg/l类胰岛素生长因子(igf-1)、10～100μg/l表皮生长因子(egf)、1～5ml/l脂质浓缩物、1～2g/l人血白蛋白、0.1～1mg/l转铁蛋白、1～4mg/l海藻糖、1250～12500u/l肝素钠和1～20ml/lpluronicf-68(10％，100×)。

上述的用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液中：所述培养液中优选含有700～1100mg/ll-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.2～0.6mg/l维生素c、4000～6500mg/lhepes、10～28μg/l类胰岛素生长因子(igf-1)、40～60μg/l表皮生长因子(egf)、2～3ml/l脂质浓缩物、1.5～2g/l人血白蛋白、0.3～0.7mg/l转铁蛋白、2～3mg/l海藻糖、10000～12500u/l肝素钠和5～15ml/lpluronicf-68(10％，100×)。

上述的用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液中：所述培养液中最优选含有862mg/ll-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.4mg/l维生素c、5958mg/lhepes、20μg/l类胰岛素生长因子(igf-1)、50μg/l表皮生长因子(egf)、2ml/l脂质浓缩物、2g/l人血白蛋白、0.5mg/l转铁蛋白、2mg/l海藻糖、12500u/l肝素钠和1～20ml/lpluronicf-68(10％，100×)。

上述用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指thermofisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。

上述用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液的制备：

1.使用电子天平精确称量500～1500mgl-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.1～1mg维生素c和2383～11915mghepes，将称量好的成分倒入烧杯中，加入500ml不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养液为基液进行溶解。

2.待步骤1中所述固体组分完全溶解后，再依次加入0.25～10mligf-1溶液，0.2～2mlegf溶液，1～5ml脂质浓缩物，5～10ml人血白蛋白，0.01～0.1ml转铁蛋白，0.1～0.4ml海藻糖，0.2～2ml肝素钠，1～20mlpluronicf-68，充分混匀。

3.将步骤2中配制的混合液转入1l容量瓶中，再补加不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养液定容至1l，并使用nahco3调节混合液ph值至7～7.2，无菌环境下进行0.22μm过滤除菌，得到无血清悬浮培养293t细胞的培养液，4℃储存备用。

4.此时得到的无血清悬浮培养293t细胞的培养液中各成分终浓度为l-丙氨酰-l谷氨酰胺500～1500mg/l、维生素c0.1～1mg/l、hepes2383～11915mg/l、igf-15～200μg/l、egf10～100μg/l、脂质浓缩物1～5ml/l、人血白蛋白1～2g/l、转铁蛋白0.1～1mg/l、海藻糖1～4mg/l、肝素钠1250～12500u/l、pluronicf-68(10％，100×)1～20ml/l。

上述制备过程均在20～30℃的无菌车间中进行，保证产品无菌。

上述无血清悬浮培养293t细胞的培养液可用于293t细胞的无血清悬浮驯化培养和传代培养。其中所述培养液将常用的l谷氨酰胺改为l-丙氨酰-l谷氨酰胺，以减少细胞大规模培养过程中毒性氨的浓度，增加氨基酸的利用；该培养液还含有类胰岛素生长因子、转铁蛋白、人血清白蛋白、脂质浓缩物、海藻糖、肝纳素、pluronicf-68和表皮生长因子(egf)，可作为血清替代物为细胞提供必需的营养物质，肝纳素的添加可缓解细胞培养过程中的结团现象，以增加细胞的培养效率。

本发明公开的无血清悬浮培养293t细胞的培养液，各成分稳定，来源明确，培养的细胞批次间稳定，质量可控。使用该细胞培养液培养的细胞增殖快，细胞活性保持周期长，长期培养细胞不结团，冻存效率高，成本低廉；并与传统293t细胞贴壁培养基的相比，该配方培养的悬浮细胞在转染hiv慢病毒时转染效率更高。

本发明所述的无血清悬浮培养293t细胞的培养液适用于规模化生产，能为生物医疗行业提供质美价廉的293t细胞无血清悬浮培养液。

附图说明

图1为本发明的无血清悬浮培养293t细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293t细胞形态比较。

其中：a为本发明的无血清悬浮培养293t细胞的培养液培养的293t的形态；b为市售的无血清培养基培养的293t的形态。

图2为本发明的无血清悬浮培养293t细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293t细胞包装hiv慢病毒的效率对比。

其中：a为本发明的无血清悬浮培养293t细胞的培养液培养的293t细胞的包装效率；b为市售的无血清培养基培养的293t细胞的包装效率。

具体实施方式

说明：本发明中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指thermofisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。

实施例1：最佳配方无血清悬浮培养293t细胞的培养液的制备

1.使用电子天平精确称量862mgl-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.4mg维生素c和5958mghepes，将称量好的成分倒入烧杯中，加入500ml不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养液为基液进行溶解。

2.待步骤1中所述固体组分完全溶解后，再依次加入1mligf-1溶液，1mlegf溶液，2ml脂质浓缩物，10ml人血白蛋白，0.05ml转铁蛋白，0.2ml海藻糖，2ml肝素钠，10mlpluronicf-68，充分混匀。

3.将步骤2中配制的混合液转入1l容量瓶中，再补加不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养液定容至1l，并使用nahco3调节混合液ph值至7～7.2，无菌环境下进行0.22μm过滤除菌，得到无血清悬浮培养293t细胞的培养液。

4.将步骤3中得到的无血清悬浮培养293t细胞的培养液转入带螺旋盖的塑料瓶中，得到无血清悬浮培养293t细胞的培养液商品，4℃储存，保质期6个月。

上述的igf-1、egf、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝纳素、pluronicf-68等成分以市售产品为例，但不限定于所述产品，按照药典规定即可。

优选的，igf-1供应商为货号phg0078，规格20μg/瓶；egf供应商为货号phg0311，规格100μg/瓶；人血白蛋白品牌为安普莱士，国药准字s10920009，规格为10g，50ml/瓶；转铁蛋白供应商为sigma，货号为t2252，规格为100mg/瓶；海藻糖供应商为sigma，货号为t9531，规格为10mg/瓶；肝素钠供应商为南京新百，国药准字h32025851，规格为2ml，12500u/支；pluronicf-68(10％，100×)供货商为货号24040032，规格100ml/瓶。

其中，igf-1使用1ml0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为20μg/ml；egf使用2ml无菌pbs缓冲液完全溶解，浓度为50μg/ml；转铁蛋白使用10ml0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为10mg/ml；海藻糖使用1ml0.9％医用生理盐水完全溶解，浓度为10mg/ml。

实施例2：293t细胞的悬浮驯化培养

1.293t细胞的复苏和接种

(1)从液氮灌中取出冻存的293t细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。

(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。

(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的t75cm²瓶中，置37℃，5％co2的培养箱中培养2天达到70％～80％汇合状态。

2.293t细胞的悬浮驯化

(1)吸弃除无血清培养基，并加入并加入0.05％胰酶消化剂使293t细胞消化脱离培养瓶表面，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时加入10ml无血清完全培养基终止消化。

(2)收集细胞，300g离心3min，用无血清完全培养基重悬，再将全部细胞接种于新的培养瓶中；置37℃，5％co2的培养箱中培养2天，重复步骤2中(1)和(2)7-9次，直至细胞开始悬浮增殖，将全部细胞转入细胞培养袋(规格2l)培养至密度为2×10⁶cell/ml，培养过程中定期晃动细胞培养袋，并及时进行补液。

(3)培养结束时，观察细胞状态并拍照，见图1(a)。

3.细胞冻存

将细胞培养液收集至250ml离心管中，离心收集细胞，并使用无血清冻存液进行冻存，冻存密度均为4×10⁶cell/支/ml。

4.对照组

对照组中使用的培养基为无血清293sfmii培养基(gibco，cat.no.10970-010)，操作按照本实施例中1～3进行，培养结束时，观察细胞状态并拍照，见图1(b)。

5.结果分析

对比两组培养基悬浮驯化培养293t细胞的细胞状态发现，本发明中的293t细胞培养基比无血清293sfmii培养基培养速率快，培养效率高，在培养结束时，本发明的培养基培养的细胞不易结团，而市售培养基培养的细胞易结团，结团则会影响细胞生长效率，降低细胞的生物学活性。

实施例3：293t细胞的包装效率

1.细胞的复苏、接种和培养

(1)从液氮灌中取出冻存的293t细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。

(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。

(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的t75cm²瓶中，置37℃，5％co2的培养箱中培养24h后，观察细胞状态，收集细胞，300g，离心3min。

(4)加入培养基重悬细胞，将细胞转移至1l摇瓶中，0-48h搅拌速度为40r/min，培养48h后，搅拌速度为60r/min，置于37℃，5％co2条件下扩大培养。

2.hiv慢病毒的包装

(1)hiv慢病毒是由pspax2包装质粒、pmd2g包装质粒和psingfphiv慢病毒表达质粒三种质粒包装而成，三种质粒由本实验室保存，三种质粒经过无内毒素高纯度抽提获得。

(2)将三种质粒按照下表添加到50ml离心管中。

(3)加入cacl2溶液156.25μl，快速摇匀，约10s；

(4)加入2×hbs1250μl，快速摇匀30s，静置2min30s；

(5)吸取2.5ml293t无血清完全培养基加入上述混合物中，充分吹打混匀，获得复合物；

(6)取摇瓶中细胞，计数4×10⁷个293t细胞，转移至离心管中，离心后，使用293t无血清完全培养基50ml重悬，并接种于新的细胞培养袋(规格500ml)中。

(7)将复合物逐滴均匀地分别加入含有4×10⁷个293t细胞中，混匀，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；

(8)培养12-14h后进行细胞补液，混匀，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；

(9)继续培养细胞36h后，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，见图3(a)。

3.对照组

对照组中使用的培养基为293sfmii无血清培养基，操作按照本实施例中1—2中的步骤进行，转染结束时，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，见图3(b)。

4.结果分析

在转染36h后，本发明公开的无血清培养基的转染效率明显高于293sfmii无血清培养基。

实施例4：293t细胞的一次性生物反应器大规模悬浮培养

1.293t细胞的复苏接种和培养

(1)从液氮灌中取出冻存的293t细胞，每支体积为1ml，迅速丢入40℃水浴锅中并快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。

(2)将细胞溶液转入15ml离心管中，每支离心管中以1:9的比例加入无血清培养基，即1ml细胞溶液加9ml培养基，300g，离心3min。

(3)加入1ml培养基将细胞重悬，两支并一支，共2ml细胞溶液加入含有18ml实施1例1中无血清完全培养基的t75cm²瓶中，置37℃，5％co2的培养箱中培养24h后，观察细胞状态，收集细胞，300g，离心3min。

(4)加入培养基重悬细胞，将细胞转移至1l摇瓶中，0-48h搅拌速度为40r/min，培养48h后，搅拌速度为60r/min，置于37℃，5％co2条件下扩大培养。

2.一次性生物反应器的大规模培养

293t细胞被用于基因治疗过程的慢病毒包装工艺，基因治疗属于个体化治疗，293t细胞不需要持续培养，慢病毒现用现包，这样生产的慢病毒滴度高，侵染效率也高，所以使用一次性生物反应器既能节约成本，又能进行个体化设计，比较符合基因治疗的要求。

一次性生物反应器主要包括：细胞培养袋、呼吸袋、取样器。

主要步骤为：

(1)当实施例5步骤1中细胞培养至3×10⁵—6×10⁵cell/ml，将细胞全部接种至5l振荡激流式一次性生物反应器中，通入co2和0.5mmol/lnaoh调节ph7.0-7.2，控制温度为37℃，通过自动控制系统通入混合o2/n2/空气控制do40％-50％，起始转速55r/min，随培养体积扩大提高至65r/min。

(2)每24h取样，计算细胞密度及存活率，测定葡萄糖和乳酸浓度。

(3)当细胞密度大于1×10⁶cell/ml开始流加培养，流加率为0.6-1，即前24h培养体积的0.6-1倍。

(4)培养4-6天，当细胞密度达到2×10⁶个cell/ml，按照一定的质粒浓度，添加质粒进行病毒包装，此时包装的病毒即可满足一个患者的需求。

实施例5：无血清悬浮培养293t细胞的培养液配方

是以市售不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养基为基液，其中含有500mg/ll-丙氨酰-l谷氨酰胺、0.1mg/l维生素c、2383mg/lhepes、5μg/l类胰岛素生长因子(igf-1)、10μg/l表皮生长因子(egf)、1ml/l脂质浓缩物、1g/l人血白蛋白、0.1mg/l转铁蛋白、1mg/l海藻糖、1250u/l肝素钠和1ml/lpluronicf-68(10％，100×)。

配制方法同实施例1。

实施例6：无血清悬浮培养293t细胞的培养液配方

是以市售不含l-谷氨酰胺的高糖dmem-f12培养基为基液，其中含有1500mg/ll-丙氨酰-l谷氨酰胺、1mg/l维生素c、11915mg/lhepes、200μg/l类胰岛素生长因子(igf-1)、100μg/l表皮生长因子(egf)、5ml/l脂质浓缩物、2g/l人血白蛋白、1mg/l转铁蛋白、4mg/l海藻糖、12500u/l肝素钠和20ml/lpluronicf-68(10％，100×)。

配制方法同实施例1。