本发明涉及一种高活性双歧杆菌菌粉真空干燥生产工艺及应用，属于食品技术领域。
背景技术：
双歧杆菌是人体及动物肠道内的固有菌群，在肠道微生态稳定及宿主生理功能调节方面具有重要作用。因此，从20世纪80年代起，双歧杆菌被广泛应用于发酵乳制品行业，并且应用于食品和膳食补充剂，在现代食品产业中具有广阔的市场前景。市售常见的双歧杆菌活菌产品有：酸奶、双歧杆菌片剂、双歧杆菌巧克力等，这些产品大多由双歧杆菌菌粉所制得。现阶段市售双歧杆菌菌粉多由冷冻干燥的方式来制得，冷冻干燥尽管能获得较高存活率的双歧杆菌菌粉，但冷冻干燥存在着生产设备要求高、干燥过程中耗能高、产量低等缺点，这些问题极大地提升了双歧杆菌菌粉的制备成本。真空干燥相比冷冻干燥具有操作简便、设备要求低，生产成本低等优点，但真空干燥也拥有无法制备高存活率菌粉的缺点，因此提升双歧杆菌真空干燥存活率显得尤为重要。
专利cn201510872948.0、cn200310103234.0及cn201110147416.2提高双歧杆菌干燥存活率的方法多集中于双歧杆菌干燥保护剂配方的研究，通过糖、蛋白质、盐等物质的筛选来优化干燥保护剂配方从而提高干燥存活率。干燥保护剂配方的优化、干燥工艺条件的改良、微胶囊化技术的应用尽管能一定程度上提高双歧杆菌干燥存活率，但上述方法的提高程度有限，且操作步骤繁琐，不适于大规模的工业化应用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服双歧杆菌真空干燥存活率低，提供一种高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉生产工艺，能显著提高双歧杆菌的真空干燥存活率和胃肠道耐受性，提供一种合适的双歧杆菌菌粉制备策略。
本发明的第一个目的是提供一种高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉的生产方法，所述方法是以非水溶性膳食纤维为介质添加至培养基中，培养双歧杆菌至形成生物膜，再收集双歧杆菌生物膜，进行真空干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌生物膜是在含有非水溶性膳食纤维的培养基中培养获得。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括谷物粉、豆类粉、果蔬粉、菌菇粉和膳食同源食物粉剂的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维包括黄豆粉、荞麦粉、芹菜粉、核桃壳粉、玉米粉、黑木耳粉、葡萄籽粉、山楂粉或猴头菇粉。
在本发明的一种实施方式中，所述非水溶性膳食纤维的含量为10～30g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌包括假小链双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、或动物双歧杆菌乳亚种。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基含有：酵母粉5～8g/l，无水乙酸钠5～8g/l，牛肉膏10～16g/l，无水葡萄糖20～30g/l，蛋白胨10～16g/l，七水合硫酸镁0.5～0.8g/l，磷酸氢二钾2～3g/l，一水合硫酸锰0.25～0.4g/l，柠檬酸氢二铵2～3g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/l，吐温-801g/l，非水溶性膳食纤维10～30g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)将双歧杆菌接种至含非水溶性膳食纤维的培养基中；(2)在氮气环境下，于ph5.8～6.2、35～37℃培养20～28h；(3)离心收集菌体；(4)按菌泥：干燥保护剂为1:1～3的质量比向菌泥中添加干燥保护剂，混匀；(5)将步骤(4)的混合物真空干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的培养基含有：酵母粉5g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏10g/l，无水葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉10g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)将双歧杆菌活化3代，按照体积比3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)在4℃下对双歧杆菌生物膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)是将将步骤(4)所得乳化液平铺在平板上，于室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。
本发明的第二个目的是提供应用所述方法制备的菌粉。
本发明的第三个目的是提供所述菌粉在食品、生物领域的应用，所述应用包括制备固体饮料、乳制品、发酵果蔬、巧克力、糖果、微生态制剂、益生菌片剂、益生菌胶囊。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含益生元的食品所述含益生元的食品含有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、母乳低聚糖中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述的固体饮料产品含有所述双歧杆菌冻干菌粉和益生元，所述益生元包含低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、母乳低聚糖、菊粉等中一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述的固体饮料的配料组成为：双歧杆菌菌粉0.1g(终浓度为109cfu/g)，低聚果糖0.82g，低聚半乳糖0.68g，菊粉0.4g，每包2g。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌生物膜菌粉用于发酵生产乳制品、豆制品或果蔬制品。
有益效果：本发明将生物菌膜技术应用于双歧杆菌的发酵生产中，以非水溶性膳食纤维作为固形界面，使其在固相界面形成菌膜，达到提高自身抗逆性的效果，从而显著提高双歧杆菌真空干燥存活率，相比于未利用生物成膜技术制备的菌粉存活率提高3～5倍，菌粉活菌数达到1-5×1010cfu/g,解决了在开发高活性双歧杆菌真空干燥菌粉中的关键技术问题。本发明制备的高活性、强抗逆性双歧杆菌菌粉可用于固体饮料、发酵剂等产品中，本发明中添加的非水溶性膳食纤维作为益生元提高了菌粉的功能。
具体实施方式
存活率计算方法：将冻干菌粉用无菌蒸馏水复溶至冻干前体积，通过平板倾注法测定活菌浓度，计算冻干存活率。存活率＝100％×冻干后活菌数/冻干前活菌数。
实施例1：假小链双歧杆菌的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：
假小链双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏10g/l，无水葡萄糖20g/l，鱼粉蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉10g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化假小链双歧杆菌的真空干燥存活率是41％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为60％。
对照例1
按实施例1相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例1相同。发酵后未形成菌膜，对存活率进行测定，结果显示，对照组真空干燥存活率是3％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为13％。
实施例2
按照实施例1的操作步骤，区别在于，以燕麦麸皮粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以燕麦麸皮粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为47％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为49％。
实施例3
按照实施例1的操作步骤，区别在于，更换干燥保护剂，干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l水苏糖、30g/l蔗糖、0.5g/l维生素c，ph为6.5。菌膜化假小链双歧杆菌的真空干燥存活率是45％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为43％。
实施例4：长双歧杆菌长亚种的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：
酵母粉6g/l，无水乙酸钠4g/l，牛肉膏12g/l，无水葡萄糖25g/l，蛋白胨12g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化长双歧杆菌长亚种的真空干燥存活率是45％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为57％。
对照例2
按实施例4相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例4相同。发酵过程未形成菌膜，经检测，对照组真空干燥存活率是5％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为9％。
实施例5
按照实施例4相同步骤进行操作，区别在于，以荞麦粉(15g/l)和芹菜粉(15g/l)取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以荞麦粉和芹菜粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为50％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为47％。
实施例6
按照实施例4相同步骤进行操作，区别在于，将真空干燥保护剂替换为：120g/l脱脂乳粉、20g/l岩藻糖、20g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化长双歧杆菌长亚种的真空干燥存活率是44％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为57％。
实施例7：长双歧杆菌婴儿亚种的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏10g/l，无水葡萄糖25g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：120g/l脱脂乳粉、40g/l海藻糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化长双歧杆菌婴儿亚种的真空干燥存活率是39％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为46％。
对照例3
按实施例7相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例7相同。结果显示，发酵过程未形成生物膜，真空干燥后长双歧杆菌婴儿亚种的存活率是6％。
实施例8
按照实施例7，以核桃壳粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以核桃壳粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为39％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为34％。
实施例9
按照实施例7，区别在于，冻干保护剂配方为：120g/l脱脂乳粉、40g/l海藻糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化长双歧杆菌婴儿亚种的真空干燥存活率是35％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为44％。
实施例10：两歧双歧杆菌的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：按照重量比，菌膜发酵培养基的配方组成包括：
酵母粉5g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏10g/l，无水葡萄糖25g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化两歧双歧杆菌的真空干燥存活率是33％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为40％。
对照例4
按实施例10相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例10相同。结果显示，发酵过程未形成菌膜，未形成菌膜的两歧双歧杆菌真空干燥存活率是3％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为11％。
实施例11
按照实施例10，以玉米粉取代黄豆粉，进行生物膜发酵，真空干燥结果显示，以玉米粉为固体介质形成的生物膜真空干燥存活率为30％，显著高于非生物膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为41％。
实施例12
按照实施例10，更换真空干燥保护剂，新的真空干燥保护剂配方为：100g/l乳清蛋白、20g/l海藻糖、5g/l谷氨酸钠、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化两歧双歧杆菌的真空干燥存活率是38％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为35％。
实施例13：青春双歧杆菌的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏12g/l，无水葡萄糖25g/l，蛋白胨12g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.0g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵3g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化青春双歧杆菌的真空干燥存活率是32％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为36％。
对照例5
按实施例13相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例13相同。发酵过程中未形成菌膜，对真空干燥后的存活率进行测定，结果显示，存活率为2％。
实施例14
按照实施例13的步骤进行实施，区别在于，以猴头菇粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以猴头菇粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为38％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为41％。
实施例15
按照实施例13的步骤，区别在于，真空干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、20g/l海藻糖、10g/l菊粉、5g/l谷氨酸钠、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化青春双歧杆菌的真空干燥燥存活率是40％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为36％。
实施例16：短双歧杆菌的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏12g/l，无水葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化短双歧杆菌的真空干燥存活率是35％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为37％。
对照例6
按实施例16相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例16相同。发酵过程中未形成菌膜，真空干燥后的存活率是2％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为9％。
实施例17
按照实施例16，以木耳粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以木耳粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为38％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为41％。
实施例18
按照实施例16，区别在于，真空干燥保护剂的配方为：100g/l脱脂乳粉、20g/l海藻糖、10g/l菊粉、5g/l谷氨酸钠、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化短双歧杆菌的真空干燥存活率是30％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为30％。
实施例19：动物双歧杆菌动物亚种的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉6g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏12g/l，无水葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。
(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化动物双歧杆菌的真空干燥存活率是38％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为41％。
对照例7
按实施例19相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例19相同。发酵过程中未形成菌膜，真空干燥存活率是3％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为16％。
实施例20
按照实施例19，区别在于，以葡萄籽粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以葡萄籽粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为42％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为46％。
实施例21
按照实施例19，区别在于，真空干燥保护剂配方为：120g/l脱脂乳粉、40g/l海藻糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化动物双歧杆菌的真空干燥存活率是33％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。
实施例22：动物双歧杆菌乳亚种的真空干燥
(1)双歧杆菌菌膜发酵培养基制备：酵母粉5g/l，无水乙酸钠5g/l，牛肉膏12g/l，无水葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，三水合磷酸氢二钾2.6g/l，一水合硫酸锰0.25g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，吐温-801g/l，黄豆粉20g/l。(2)双歧杆菌菌膜的发酵制备：将双歧杆菌活化3代，按照3-5％的接种比例，转接到10l发酵罐中，持续通入氮气，调整转速，37度恒定ph(ph＝6)培养24小时。
(3)双歧杆菌菌膜的收集：在4℃下对双歧杆菌菌膜发酵液进行离心收集菌泥，离心条件为：转速为6000rpm/min，离心时间为10分钟，得到双歧杆菌菌泥。
(4)添加干燥保护剂：将所得菌泥和干燥保护剂按照重量体积比(1:1)混合均匀。上述干燥保护剂配方为：100g/l脱脂乳粉、30g/l海藻糖、30g/l蔗糖、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。
(5)真空干燥：将步骤(3)所得乳化液，平铺在平板上，真空干燥条件为：室温条件下在-0.1mpa下真空干燥18-24h。真空干燥后即可获得双歧杆菌菌粉。
经检测，菌膜化动物双歧杆菌乳亚种的真空干燥存活率是52％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为45％。
对照例8
按实施例22相同的步骤进行菌粉制备，唯一区别为发酵培养基中不添加黄豆粉，其余条件与实施例22相同。发酵过程中未形成菌膜，真空干燥存活率是6％。将菌粉于25度下存放12周，存活率为13％。
实施例23
按照实施例22，以山楂粉取代黄豆粉，进行菌膜发酵，真空干燥结果显示，以山楂粉为固体介质形成的菌膜真空干燥存活率为50％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。将菌粉于25度下存放12周，存活率为46％。
实施例24
按照实施例22，区别在于，真空干燥保护剂配方为：80g/l脱脂乳粉、20g/l海藻糖、20g/l蔗糖、10g/l菊粉、5g/l谷氨酸钠、0.5g/l半胱氨酸盐酸盐，ph为6.5。菌膜化动物双歧杆菌的真空干燥燥存活率是33％，显著高于非菌膜状态的菌体真空干燥存活率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。