一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂、菌剂制备方法与应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体是涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂、菌剂制备方法与应用。

背景技术：

植物病害是影响农业高产稳产和优质的主要因素之一，其病原物主要包括真菌、细菌、线虫和病毒等。例如尖孢镰刀菌是一种土传真菌病害，可引起瓜类、茄类等百种植物枯萎病的发生，全国各地发生普遍，一般发病率10％-30％，严重时可达50％以上，随着瓜类种植面积的逐渐扩大，枯萎病已成为制约瓜类生产的最主要因素之一；根结线虫病是由根结线虫引起的一类危害植物根部的病害，据统计，在世界范围内，每年由植物寄生线虫造成的损失达1000亿美元，其中根结线虫造成的经济损失达数百亿美元；青枯病是由茄科劳尔氏菌引起的一种毁灭性的土传病害，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，该病可造成植株大面积的萎蔫死亡，重病田的发病率可达80％以上，严重危害着茄科作物的生长。

化学防治是控制植物病害的有效方法，具有见效快、杀菌谱广、成本低、使用简便等优点，但化学杀菌剂的长期大量使用会造成土壤、大气等环境污染、破坏生态平衡。随着近年来人们对食品安全及环境污染问题的关注，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已被严格限制使用。

植物病害生物防治是指利用有益微生物或微生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法。生物防治具有环境友好、无残留、使用过程对人畜安全等特点已逐渐受到国内外学者的关注，随着研究的不断深入，生物防治方法将逐步取代传统的化学防治手段，具有广阔的应用前景。虽然生物防治受到越来越多的重视，但是能够实际应用到植物病害防治上的还比较少，在实验室分离得到的具有较好生防效果的微生物，在其应用过程中会出现因环境因素或者菌种本身的原因在土壤中存活率低或无法存活等问题，其防治效果不稳定。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂、菌剂制备方法与应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一株广谱抗植物病害的解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)amcc100200保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14170。

一种所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂：该菌剂由所述解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌液经喷雾干燥获得。

进一步，所述菌液浓度为1.0×10¹⁰～1.2×10¹⁰cfu/ml。

进一步，该菌剂中有效活菌数为5.0×10¹⁰～1.0×10¹¹cfu/g。

一种所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌amcc100200划线接种于lb固体培养基平板上，于37℃培养24h；

s2、种子液制备：将活化好的解淀粉芽孢杆菌amcc100200接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养24h获得种子液；

s3、种子罐发酵培养：将步骤s2中的种子液以5～8％的接种量接种到50l种子罐中，种子罐中液体培养基装液量为30l，于37℃培养8h获得发酵培养物；

s4、发酵培养：将步骤s3中的发酵培养物以5～8％的接种量接种到500l发酵罐中，发酵罐中液体培养基装液量为350l，37℃培养24h，得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的发酵液；

s5、将步骤s4的发酵液浓缩后获得所述菌液，将所述菌液经喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌剂。

进一步，所述步骤s1和s2中lb培养基配方包括：酵母膏0.5wt％，蛋白胨1wt％，氯化钠1wt％，琼脂1.6wt％，所述步骤s1和s2中lb培养基ph7.0，使用前在121℃下高压灭菌20min；所述步骤s3和s4中所用的液体培养基配方包括：玉米粉2.88wt％，豆饼粉1.68wt％，caco30.7wt％，葡萄糖0.5wt％，kh2po40.5wt％，mgso4·7h2o0.02wt％，mnso4·h2o0.02wt％，所述步骤s3和s4中所用的液体培养基ph7.0～7.2；所述步骤s5中喷雾干燥的温度为进口风200℃，出口风80℃。

一种所述解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌株或所述菌剂在防治番茄根结线虫病中的应用。

一种所述解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌株或所述菌剂在防治黄瓜炭疽病中的应用。

进一步，将所述菌剂溶水后形成菌液并在番茄定植前开沟施入，所述菌剂使用量10g/亩。

进一步，将所述菌剂溶水后形成菌液并对植物进行叶面喷雾，所述菌剂使用量1kg/亩，所述菌液的浓度为500亿cfu/ml。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述解淀粉芽孢杆菌amcc100200对多种植物病原菌具有很强的抑制作用，比如：对黄瓜炭疽病病原菌抑制率为73.78％，对小麦纹枯病病原菌抑制率为70.22％，对芦笋卷枯病病原菌抑制率为50.02％，对苹果轮纹病原菌抑制率为74.20％，对小麦根腐病原菌抑制率为57.34％，对尖孢镰刀菌抑制率为62.80％，对层出镰刀菌抑制率为61.31％，对串珠镰刀菌抑制率为57.87％，对腐皮镰刀菌抑制率为71.41％。另外该菌对根结线虫二龄幼虫具有很强的杀伤作用，其48h发酵液处理根结线虫二龄幼虫24h后致死率可达到90％。

(2)田间试验结果表明，使用解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌剂处理后，植物的黄瓜炭疽病病情指数下降74.41％，番茄根结线虫病病情指数下降了65％。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌株的菌落形态。

图2是解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌株的显微形态。

图3是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对黄瓜炭疽病病原菌的拮抗作用。

图4是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对小麦纹枯病病原菌的拮抗作用。

图5是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对苹果轮纹病原菌的拮抗作用。

图6是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对小麦根腐病原菌的拮抗作用。

图7是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对尖孢镰刀菌的拮抗作用。

图8是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对层出镰刀菌的拮抗作用。

图9是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对串珠镰刀菌的拮抗作用。

图10是解淀粉芽孢杆菌amcc100200对腐皮镰刀菌的拮抗作用。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1amcc100200菌株的分离、鉴定及保藏

1.1amcc100200菌株的分离

从植物根际土壤中筛选出一株广谱抗植物病害的菌株，命名为amcc100200菌株，具体分离方法为：

取植物根际土壤10g，装入装有无菌玻璃珠和90ml无菌水的250ml锥形瓶中，充分摇匀。将摇匀后的锥形瓶放置于37℃的摇床中，180rpm振荡30min。取出后于超净工作台上进行梯度稀释，得到10^-3梯度、10^-4梯度、10^-5梯度、10^-6梯度和10^-7梯度的稀释液。分别将这几个梯度的稀释液在lb培养基平板上涂布，每个稀释梯度设置6个平行，用封口膜封口后置于37℃培养箱中进行培养。24h后观察生长情况，根据菌落大小、形状和颜色等特征进行分类。使用接种环挑取具有差异的单菌落在lb培养基平板上三区划线进行纯化，根据菌落特点剔除重复的菌株，挑取将得到的菌株转接到lb培养基斜面后于4℃进行保藏。

1.2amcc100200菌株的鉴定

所述amcc100200菌株的菌落形态见图1。

所述amcc100200菌株的显微形态见图2。

所述amcc100200菌株的菌落淡黄色，不透明，边缘不规则，表面粗糙。革兰氏染色镜检观察，阳性，细胞杆状，芽孢椭圆形。其硝酸盐还原实验、明胶水解、淀粉水解呈阳性，v-p实验、柠檬酸盐利用、氧化酶实验、以及产吲哚实验呈阴性，与解淀粉芽孢杆菌模式种具有相同特征。

经鉴定，所述amcc100200菌株属解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。所述amcc100200菌株的16srdna序列如序列表的序列1所示。

1.3amcc100200菌株的保藏

所述amcc100200菌株已于2017年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究)，保藏编号为cgmccno.14170。

实施例2菌剂的制备

实施例2-1

s1、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌amcc100200划线接种于lb固体培养基平板上，于37℃培养24h；

s2、种子液制备：将活化好的解淀粉芽孢杆菌amcc100200以5％接种量接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养24h获得种子液；

s3、种子罐发酵培养：将步骤s2中的种子液以5％的接种量接种到50l种子罐中，种子罐中液体培养基装液量为30l，于37℃培养8h获得发酵培养物；

s4、发酵培养：将步骤s3中的发酵培养物以5％的接种量接种到500l发酵罐中，发酵罐中液体培养基装液量为350l，37℃培养24h，得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的发酵液；

s5、将步骤s4的发酵液浓缩后获得所述菌液，将所述菌液经喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌剂。

所述步骤s1和s2中lb培养基配方包括：酵母膏0.5wt％，蛋白胨1wt％，氯化钠1wt％，琼脂1.6wt％，所述步骤s1和s2中lb培养基ph7.0，使用前在121℃下高压灭菌20min；所述步骤s3和s4中所用的液体培养基配方包括：玉米粉2.88wt％，豆饼粉1.68wt％，caco30.7wt％，葡萄糖0.5wt％，kh2po40.5wt％，mgso4·7h2o0.02wt％，mnso4·h2o0.02wt％，所述步骤s3和s4中所用的液体培养基ph7.0～7.2；所述步骤s5中喷雾干燥的温度为进口风200℃，出口风80℃。

实施例2-2

s1、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌amcc100200划线接种于lb固体培养基平板上，于37℃培养24h；

s2、种子液制备：将活化好的解淀粉芽孢杆菌amcc100200接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养24h获得种子液；

s3、种子罐发酵培养：将步骤s2中的种子液以8％的接种量接种到50l种子罐中，种子罐中液体培养基装液量为30l，于37℃培养8h获得发酵培养物；

s4、发酵培养：将步骤s3中的发酵培养物以8％的接种量接种到500l发酵罐中，发酵罐中液体培养基装液量为350l，37℃培养24h，得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的发酵液；

s5、将步骤s4的发酵液浓缩后获得所述菌液，将所述菌液经喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌剂。

所述步骤s1和s2中lb培养基配方包括：酵母膏0.5wt％，蛋白胨1wt％，氯化钠1wt％，琼脂1.6wt％，所述步骤s1和s2中lb培养基ph7.0，使用前在121℃下高压灭菌20min；所述步骤s3和s4中所用的液体培养基配方包括：玉米粉2.88wt％，豆饼粉1.68wt％，caco30.7wt％，葡萄糖0.5wt％，kh2po40.5wt％，mgso4·7h2o0.02wt％，mnso4·h2o0.02wt％，所述步骤s3和s4中所用的液体培养基ph7.0～7.2；所述步骤s5中喷雾干燥的温度为进口风200℃，出口风80℃。

实施例2-3

s1、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌amcc100200划线接种于lb固体培养基平板上，于37℃培养24h；

s2、种子液制备：将活化好的解淀粉芽孢杆菌amcc100200接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养24h获得种子液；

s3、种子罐发酵培养：将步骤s2中的种子液以6.5％的接种量接种到50l种子罐中，种子罐中液体培养基装液量为30l，于37℃培养8h获得发酵培养物；

s4、发酵培养：将步骤s3中的发酵培养物以6.5％的接种量接种到500l发酵罐中，发酵罐中液体培养基装液量为350l，37℃培养24h，得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的发酵液；

s5、将步骤s4的发酵液浓缩后获得所述菌液，将所述菌液经喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌amcc100200的菌剂。

所述步骤s1和s2中lb培养基配方包括：酵母膏0.5wt％，蛋白胨1wt％，氯化钠1wt％，琼脂1.6wt％，所述步骤s1和s2中lb培养基ph7.0，使用前在121℃下高压灭菌20min；所述步骤s3和s4中所用的液体培养基配方包括：玉米粉2.88wt％，豆饼粉1.68wt％，caco30.7wt％，葡萄糖0.5wt％，kh2po40.5wt％，mgso4·7h2o0.02wt％，mnso4·h2o0.02wt％，所述步骤s3和s4中所用的液体培养基ph7.0～7.2；所述步骤s5中喷雾干燥的温度为进口风200℃，出口风80℃。

实施例3解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌株的广谱抗植物病害能力测定3.1解淀粉芽孢杆菌amcc100200拮抗真菌病害能力测定

用接种环挑取活化的细菌与病原真菌的菌丝块分别同时接入培养皿平板(培养皿直径9cm，两者相距5cm，3次重复)。再分别以细菌和病原真菌在培养皿平板上的纯培养为对照，恒温培养，逐日观察菌落的生长和细菌的抑制作用。连续观察，待对照菌株菌丝长满培养皿时测量处理病原菌菌落直径，计算抑菌率。抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100(％)。

如图2-10所示为解淀粉芽孢杆菌amcc100200对不同病原真菌的抑制效果，其中各图中左侧培养皿里为对照菌落，右侧培养皿里为处理菌落。

经计算结果表明：本发明解淀粉芽孢杆菌amcc100200对多种植物病原菌具有很强的抑制作用，对黄瓜炭疽病病原菌抑制率为73.78％，对小麦纹枯病病原菌抑制率为70.22％，对芦笋卷枯病病原菌抑制率为50.02％，对苹果轮纹病原菌抑制率为74.20％，对小麦根腐病原菌抑制率为57.34％，对尖孢镰刀菌抑制率为62.80％，对层出镰刀菌抑制率为61.31％，对串珠镰刀菌抑制率为57.87％，对腐皮镰刀菌抑制率为71.41％。

3.2解淀粉芽孢杆菌amcc100200杀线虫能力测定

按前述方法将菌种活化，将活化的解淀粉芽孢杆菌amcc100200种子液按1％的接种量接种到lb液体培养基(培养基组成及质量：蛋白胨10g、nacl10g、酵母膏5g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃灭菌20min)，37℃、180r/min摇床培养后得发酵液。取0.2ml(约100条左右)线虫悬液和0.8ml的48h发酵液加入1.5ml离心管中，28℃培养24h后，小心吸去0.8ml上清，并加入0.2ml浓度为1mol/l的naoh溶液混匀，立刻在显微镜下观察，计算线虫致死率。线虫死活判断标准：线虫活跃、弯曲，加入naoh溶液后变弯曲，线虫为活；僵直不动，加入naoh溶液后仍然僵直，线虫为死。

实验结果表明：该菌对根结线虫二龄幼虫具有很强的杀伤作用，其48h发酵液处理根结线虫二龄幼虫24h后致死率可达到90％。

实施例4防效验证实验

4.1黄瓜炭疽病田间小区试验

2015年5月至7月在山东省临沂市向城镇盛庄村黄瓜大棚进行田间试验。实验棚往年发生严重的黄瓜炭疽病。黄瓜品种为中农8号，试验期间未使用杀菌剂，试验共设置3个处理组：(1)将amcc100200菌剂溶于水后用手动喷雾器进行叶面喷雾，所述amcc100200菌剂溶水后浓度为500亿cfu/ml，amcc100200菌剂使用量：1kg/亩；(2)将50％咪鲜胺可湿性粉剂溶于水后用手动喷雾器进行叶面喷雾，所述50％咪鲜胺可湿性粉剂稀释倍数：500倍，使用量：25g/亩)；(3)清水对照。每个小区30m²，每小区有60株黄瓜，每个处理组均设3个重复小组，小区随机分布，于黄瓜炭疽病发病初期开始喷施，以后每隔一周进行喷施，共喷施3次。按gb/t17980.112-2004相关标准进行试验和评价。每个小区随机选取15株调查，每株自下而上调查10片叶。施药前调查发病基数，第3次施药后14d调查病情指数，计算防治效果。

表1amcc100200菌剂对黄瓜炭疽病的防治效果

由表1结果可知：amcc100200菌剂水溶后对黄瓜炭疽病具有良好的防治效果，其防治效果可达到74.41％，对照药剂50％咪鲜胺可湿性粉剂对黄瓜炭疽病的防治效果可以达到85.94％。

4.2番茄根结线虫病田间小区试验

试验于山东省德州市陵县丁庄乡小庄村塑料蔬菜大棚内进行。番茄茴香轮作，连续种植多年，番茄根结线虫病严重。本试验共3个处理组：(1)amcc100200菌剂作底施处理，在番茄定植前开沟施入，amcc100200菌剂使用量：10kg/亩；(2)空白组处理：不作任何处理；(3)化学农药处理：阿维菌素2000倍稀释液在番茄移栽时作灌根处理，番茄定植后覆土，阿维菌素使用量：2kg/亩。每个处理组均设3个重复小组，每小组处理面积约为27m²(3.6m×7.5m)，包括3垅，共6行，种植121株番茄。于番茄收获后统计根结指数以及虫口密度等指标。

表2解淀粉芽孢杆菌amcc100200菌剂对根结线虫的影响

amcc100200菌剂水溶后对番茄根结线虫病具有良好的防治效果，与空白组相比，根结数减少了68.06％，卵囊数减少了92.01％，虫口密度降低了62.40％，说明amcc100200菌剂对根结线虫的发生与发展具有很强的抑制作用。

序列表

<110>安徽六国化工股份有限公司、山东农业大学

<120>一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂、菌剂制备方法与应用

<141>2017-11-06

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1426

<212>dna

<213>bacillusamyloliquefaciens

<400>1

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