七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子LIP-P及构建重组质粒载体的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种七鳃鳗神经轴体特异性表达启动子lip-p及构建重组质粒载体的方法。

背景技术：

启动子是基因表达的重要顺式调控元件，基因的表达调控中转录环节是最主要的调控位点，而启动子的调控在转录环节中又占据着十分重要的地位，启动子也是基因工程表达载体的一个重要元件，直接影响基因表达效率。目前，已有将基因构建重组质粒载体通过胚胎显微注射的方法来实现哺乳动物及斑马鱼的基因功能和信号通路研究。但是，用于电转的七鳃鳗细胞是从新鲜的离体组织中消化得到，具有一定的特殊性，为质粒的转染带来较大的技术难度。迄今为止，现有哺乳动物的表达质粒载体携带目的基因在七鳃鳗细胞或个体中不能表达，七鳃鳗基因功能和信号通路研究还没有取得突破性进展。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p及构建重组质粒载体的方法

本发明的技术解决方案是：一种七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p，其特征在于：dna序列如seqidno.1所示。

一种以上述七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p构建重组质粒载体的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a.以七鳃鳗基因组为模板，以dna序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示的引物进行pcr扩增，回收目的基因；

b.将所回收的目的基因与pmd18-tvector相连；

c.将连接后的产物lip-p-pmd18-t转化到dh5α感受态细胞中，获取阳性克隆菌，以分别带有bamhi和hindiii酶切位点的引物进行pcr扩增并抽提lip-p-pmd18-t质粒；

d.分别用bamhi和hindiii酶切lip-p-pmd18-t质粒和表达基因质粒，37℃酶切3h；

e.将酶切后的lip-p片断和表达基因质粒，16℃连接4h，通过cacl2法转化至克隆菌dh5α中，抽提重组质粒载体。

本发明的七鳃鳗神经轴体特异性表达启动子lip-p，其启动子lip-p重组质粒可与表达基因质粒构建能在七鳃鳗细胞或个体中表达的重组质粒载体，为转基因调控七鳃鳗细胞及个体功能研究和信号通路研究提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例构建的启动子-pacgfp1-1质粒的电泳结果图。

图2为本发明实施例构建的重组质粒载体转染到七鳃鳗髓细胞的示意图。

图3为本发明实施例构建的重组质粒载体转染到七鳃鳗胚胎细胞的示意图。

具体实施方式

1.本发明的七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p，其dna序列如seqidno.1所示。

2.本发明的以上述七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p构建重组质粒载体的方法，按照如下步骤进行：

a.以七鳃鳗基因组为模板，以dna序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示的引物进行pcr扩增，回收目的基因，经测序其dna序列如seqidno.1所示；

b.将所回收的目的基因与pmd18-tvector相连，即目的基因dna片段与pmd18-tvector按照合适的比例16℃，连接4h；

c.将连接后的产物lip-p-pmd18-t转化到dh5α感受态细胞中，获取阳性克隆菌，以分别带有bamhi和hindiii酶切位点的引物进行pcr扩增并抽提lip-p-pmd18-t质粒；

d.分别用bamhi和hindiii酶切lip-p-pmd18-t质粒和gfp质粒，37℃酶切3h；

e.将酶切后的lip-p片断和gfp质粒，16℃连接4h，通过cacl2法转化至克隆菌dh5α中，抽提重组质粒载体lip-p-gfp。

所抽提重组质粒载体lip-p-gfp电泳图如图1所示。图1中marker：10000dl；1：promotor--gfp，说明重组质粒载体lip-p-gfp构建成功。

实验：

1.重组质粒载体lip-p-gfp转染到七鳃鳗细胞

具体步骤如下：

1）真核质粒：提取lip-p-gfp质粒的浓度达到1μg/μl；

2）转染：采用invitrogen公司转染试剂和电转仪：

（1）事先准备1×10⁵的状态良好的七鳃鳗细胞与r液进行混合；

（2）将3ml的电解液液加到杯中，将电转仪的电压、脉冲调到适合的电压位置；

（3）然后用金针吸取1μg的真核质粒与七鳃鳗细胞进行混合；

（4）按start开始，当出现”×”的键面，电转成功；

（5）最后将金针的液体打到事先准备好无抗性的培养基中，12h、24h后分别在荧光显微镜下观察，结果如图2所示。从图2可以看出，所构建的lip-p-gfp质粒可在七鳃鳗细胞中表达。

2.重组质粒载体lip-p-gfp显微注射到七鳃鳗胚胎

具体步骤如下：

1）真核质粒：提取lip-p-gfp质粒的浓度达到1μg/μl；

2）显微注射：将事先准备好的七鳃鳗胚胎，调整显微注射的针头和角度进行注射：

（1）控制显微注射用针和开针：用p-1000micropipettepuller将硅硼酸盐玻璃管拉制成显微注射针。拉制程序如下：设定合适注射压和平衡压在式显微镜下，用手术刀截断显微注射针前端，选择有斜面，断口直径为2μm显微注射针，制备好的显微注射用针放在盛针器上，密闭保存，备用。

（2）检测注射剂量：先将测微尺用乙醇擦拭干净，滴上一滴halocarbonoil,在halocarbonoil上注射注射在放大倍镜下确定注射剂量，约为4~5nl，可通过改变注射压力、时间以及修剪显微注射针的断口直径来调节注射剂量。

（3）上样：使用无菌的微量加样器从显微注射针的后部加入待注射样品，用纯水morpholinooligonucleotide至1mm，用0.5%酚红显色，其比例为0.5%酚红，morpholinooligonucleotide（1mm）=1/9，通过显微注射针未拉制一端的管口注入。

（4）铺卵：将培养皿倒扣在体现镜的底座上，将载玻片放在培养皿上，用吸管吸取约60-70枚七鳃鳗胚吸管将胚胎在载玻片的一侧排成一列，除去多余的水分，使胚胎紧靠在载玻片的一侧。铺卵前检查胚胎的质量，七鳃鳗胚胎为卵圆形，卵母细胞受精吸水后，受精卵高高举起，受精卵晶莹饱满，直径约1mm。

（5）注射：对于1~2细胞期后的卵裂期吸取少量的注射液，将载有胚胎的显微注射皿放在显微镜载物台用低倍镜对准细胞调焦，微调摇杆找到针尖，使针尖对准细胞待注射的部位，注射角度45~60℃最佳；将样品注入胚胎，约数秒后，将手动操作仪的旋钮拉出；然后进行下一枚卵的注射，试验后，每天观察注射后卵的发育情况，结果如图3所示。从图3可以看出，所构建的lip-p-gfp质粒可在七鳃鳗胚胎中表达。

序列表

<110>辽宁师范大学

<120>七鳃鳗神经轴体组织特异性表达启动子lip-p及构建重组质粒载体的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1139

<212>dna

<213>七鳃鳗(lampetrajaponica)

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1139)

<223>用于构建重组质粒载体

<400>1

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(lampetrajaponica)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>上游引物

<400>2

<210>3

<211>320

<212>dna

<213>人工序列(lampetrajaponica)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>下游引物

<400>3