一种普利卡那肽的固相合成方法与流程

文档序号:14357375阅读:826来源:国知局

本发明为多肽合成制备领域,特别涉及普利卡那肽的合成制备方法。

技术背景

普利卡那肽结构式如下:

h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)

普利卡那肽由美国synergy公司研发成功,并于2017年1月19日获得fda的批准,该药是一种口服鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂,可以在上消化道发挥作用以刺激分泌肠液,从而维持肠道功能正常。其氨基酸肽序为h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh,其中序列的4号位与10号位,7号位与15号位分别形成两对二硫环。主要用于治疗便秘肠易激综合症(ibs-c)和慢性特发性便秘(cic),它是迄今第二个用于治疗便秘的口服多肽药物。当前关于该药物的合成专利不多,主要有深圳翰宇药业的cn201310209459.8和cn201310680490.x两个专利,以及南京工业大学的一个制备专利cn201510104385.0。深圳翰宇药业的两个专利分别采用不同的固液相合成策略,虽然都采用的不同的侧链保护剂,定向合成了两对二硫键,但是由于采用了最后液相环化的方法,合成反应液的浓度受到极大限制,会产生大量的废水,操作复杂麻烦,不适合产业化生产。南京工业大学采用了固相环化的方法,有所改进,但是纯固相合成,需要高倍数物料投入,产生大量原材料的浪费,原子利用率极差,反应时间相对较长。本发明收率基本与现有文献报道持平或略高于报道,但是总体时间成本,物料成本等大大降低,并且适用于工业化生产。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种新的普利卡那肽的固相合成方法,该方法合成效率高,物料成本大大降低,并且适用于工业化生产。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种普利卡那肽的固相合成方法,其特点是:先采用液相合成法合成六肽片段,利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上,利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对cys不同位置的保护基,直接完成两个二硫环的选择性合成,之后将其从树脂上切割下来,直接进行纯化。

本发明所述的一种普利卡那肽的固相合成方法,其进一步优选的技术方案步骤是:

a、片段缩合成各类普利卡那肽中间体:

(1)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3的合成;

(2)利用树脂的假稀释效应完成r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-

cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)-disulfide的合成,4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环;

(3)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成;4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上,7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环;

各类氨基酸保护基中:

r为z、boc、cl-z、fmoc、onbs、dnbs、troc、dts、pnz、onz、nvoc、nppoc、hfa、ddz、bpoc、nps、nsc、bsmoc、α-nsmoc、ivdde、fmoc*、mtt、alloc其中任意一个;

r1为meb、mob、trt、tmob、mmt、xan、pmbf、bn、tbu、fm、dnpe、fmoc、acm、phacm、stbu、npys、alloc其中任意一个;

r2为h、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb其中任意一个;

r3为h、ome、oet、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb、wang树脂、ctc树脂其中任意一个;

r4为bn、chx、tbu、trt、tbdms、dmnb、poc其中任意一个;

b、普利卡那肽粗肽的合成;

h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)

c、普利卡那肽的纯化和冻干。

本发明中的相关名词解释如下:

本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法,其进一步优选的技术方案是:固相合成过程中用到的偶联体系为:

(1)、单一缩合剂:dic、edc、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、tbtu、pybop、hbtu、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶;

(2)二体系缩合剂:dic/hobt、edc/hobt、dic/hosu、edc/hosu;

(3)环合试剂:哌啶/dmf、h2o2/dmf、i2/dmf、dmso/dmf、h2o2/h2o、i2/h2o、dmso/h2o;

本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法,其进一步优选的技术方案是:r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-

val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下:

(1)以fmoc-leu-oh为第一个氨基酸,与wang树脂或ctc树脂,涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8mmol/g进行缩合形成fmoc-leu-树脂,然后通过逐个偶联氨基酸的方法,偶联完成10个氨基酸树脂;之后将液相方法合成的r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-r3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上,完成全保护肽树脂的合成;

(2)、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),disulfide的合成

采用4号位、12号位mmt或者acm保护的半胱氨酸,用不同浓度的tfa进行裂解,脱除mmt或者acm后,用dmso、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环,获得目标产品;

(3)、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成

采用7号位、15号位trt、tmob、pmbf或者acm保护的半胱氨酸,用i2/dmf进行脱保护并同时进行氧化成二硫环,获得目标产品;

(4)h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-

leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成

采用不同比例的tfa进行裂解,质子捕获剂或保护基捕获剂选自:tis、edt、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等,tfa的比例大于90%。

本发明中,木瓜蛋白酶不仅可以催化该反应,对其余各类酰胺键合成都有效果,氨基酸范围包括所有20种常规氨基酸。偶联过程中,所使用的dmf:硼酸氢氧化钠(或氢氧化钾)范围为90:10~99:1;dmf:磷酸二氢钠范围为92:8~99:1,其中,硼酸氢氧化钠(或氢氧化钾)溶液范围为0.5%~20%,磷酸二氢钠范围为1%~13%。

与现有技术相比,本发明方法由于液相、固相同时开展合成,酶促合成大大提高了合成效率及合成收率,不仅极大的减少了废水、废有机溶剂、废气的产生,同时固液相合成大大降低了生产成本,提高了产品品质。

附图说明

图1为实施例所制得普利卡那肽粗品hplc图;

图2为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品hplc图;

图3为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品质谱图。

具体实施方式

以下参照附图,以下进一步描述本发明的具体技术方案,以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明,而不构成对其权利的限制。

实施例1,一种普利卡那肽的固相合成方法,先采用液相合成法合成六肽片段,利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上,利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对cys不同位置的保护基,直接完成两个二硫环的选择性合成,之后将其从树脂上切割下来,直接进行纯化。

实施例2,实施例1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法,其具体步骤是:

a、片段缩合成各类普利卡那肽中间体:

(1)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3的合成;

(2)利用树脂的假稀释效应完成r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-

cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)-disulfide的合成,4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环;

(3)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成;4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上,7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环;

各类氨基酸保护基中:

r为z、boc、cl-z、fmoc、onbs、dnbs、troc、dts、pnz、onz、nvoc、nppoc、hfa、ddz、bpoc、nps、nsc、bsmoc、α-nsmoc、ivdde、fmoc*、mtt、alloc其中任意一个;

r1为meb、mob、trt、tmob、mmt、xan、pmbf、bn、tbu、fm、dnpe、fmoc、acm、phacm、stbu、npys、alloc其中任意一个;

r2为h、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb其中任意一个;

r3为h、ome、oet、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb、wang树脂、ctc树脂其中任意一个;

r4为bn、chx、tbu、trt、tbdms、dmnb、poc其中任意一个;

b、普利卡那肽粗肽的合成;

c、普利卡那肽的纯化和冻干。

固相合成过程中用到的偶联体系为:

(1)、单一缩合剂:dic、edc、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、tbtu、pybop、hbtu、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶;

(2)二体系缩合剂:dic/hobt、edc/hobt、dic/hosu、edc/hosu;

(3)环合试剂:哌啶/dmf、h2o2/dmf、i2/dmf、dmso/dmf、h2o2/h2o、i2/h2o、dmso/h2o;

实施例3,实施例1或2所述的一种普利卡那肽的固相合成方法中:

r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-

val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下:

(1)以fmoc-leu-oh为第一个氨基酸,与wang树脂或ctc树脂,涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8mmol/g进行缩合形成fmoc-leu-树脂,然后通过逐个偶联氨基酸的方法,偶联完成10个氨基酸树脂;之后将液相方法合成的r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-r3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上,完成全保护肽树脂的合成;

(2)、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),disulfide的合成

采用4号位、12号位mmt或者acm保护的半胱氨酸,用不同浓度的tfa进行裂解,脱除mmt或者acm后,用dmso、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环,获得目标产品;

(3)、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-

cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成

采用7号位、15号位trt、tmob、pmbf或者acm保护的半胱氨酸,用i2/dmf进行脱保护并同时进行氧化成二硫环,获得目标产品;

(4)h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-

leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成

采用不同比例的tfa进行裂解,质子捕获剂或保护基捕获剂选自:tis、edt、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等,tfa的比例大于90%。

实施例4,一种普利卡那肽的固相合成方法方法实验:

一、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome的合成

(1)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-oh的合成

溶液1:称取100毫摩的boc-asn(trt)-oh、110毫摩的hosu,置于500ml的圆底烧瓶中,加入200mlthf溶解,磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2:称取110毫摩的dcc,置于小烧杯中,用100ml的thf溶解,冷却至0-5℃备用

溶液3:称取120毫摩的nh2-asp(otbu)-oh,溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中,室温下备用

在0-5℃下,将dcc溶液(溶液2)慢慢滴加到搅拌的溶液1中,反应15分钟,25℃下反应2小时,点板确定反应结束(具体反应时间以点板时间为准)。过滤除去白色沉淀,用30mlthf洗涤沉淀并过滤,合并滤液,旋蒸除去thf,得到大量白色固体,用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤,抽滤,重复洗涤3次,获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中,25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中,滴加完毕后反应继续反应1小时,反应结束(以点板为准)。用稀柠檬酸调ph值到7,旋蒸除去thf,再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间,得到大量白色沉淀,过滤,用稀柠檬酸500ml打浆洗涤,过滤,重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体,纯度:99.2%

(2)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-oh的合成

溶液1:称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-oh、110毫摩的hosu,置于500ml的圆底烧瓶中,加入200mlthf溶解,磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2:称取110毫摩的dcc,置于小烧杯中,用100ml的thf溶解,冷却至0-5℃备用

溶液3:称取120毫摩的nh2-glu(otbu)-oh,溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中,室温下备用

在0-5℃下,将dcc溶液(溶液2)慢慢滴加到搅拌的溶液1中,反应15分钟,25℃下反应2小时,点板确定反应结束(具体反应时间以点板时间为准)。过滤除去白色沉淀,用30mlthf洗涤沉淀并过滤,合并滤液,旋蒸除去thf,得到大量白色固体,用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤,抽滤,重复洗涤3次,获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中,25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中,滴加完毕后反应继续反应1小时,反应结束(以点板为准)。用稀柠檬酸调ph值到7,旋蒸除去thf,再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间,得到大量白色沉淀,过滤,用稀柠檬酸500ml打浆洗涤,过滤,重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体,纯度:99.1%。

(3)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-oh的合成

溶液1:称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-oh、110毫摩的hosu,置于500ml的圆底烧瓶中,加入200mlthf溶解,磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2:称取110毫摩的dcc,置于小烧杯中,用100ml的thf溶解,冷却至0-5℃备用

溶液3:称取120毫摩的nh2-cys(mmt)-oh,溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中,室温下备用

在0-5℃下,将dcc溶液(溶液2)慢慢滴加到搅拌的溶液1中,反应15分钟,25℃下反应2小时,点板确定反应结束(具体反应时间以点板时间为准)。过滤除去白色沉淀,用30mlthf洗涤沉淀并过滤,合并滤液,旋蒸除去thf,得到大量白色固体,用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤,抽滤,重复洗涤3次,获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中,25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中,滴加完毕后反应继续反应1小时,反应结束(以点板为准)。用稀柠檬酸调ph值到7,旋蒸除去thf,再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间,得到大量白色沉淀,过滤,用稀柠檬酸500ml打浆洗涤,过滤,重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体,纯度:99.3%。

(4)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-oh的合成

溶液1:称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-oh、110毫摩的hosu,置于500ml的圆底烧瓶中,加入200mlthf溶解,磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2:称取110毫摩的dcc,置于小烧杯中,用100ml的thf溶解,冷却至0-5℃备用

溶液3:称取120毫摩的nh2-glu(otbu)-oh,溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中,室温下备用

在0-5℃下,将dcc溶液(溶液2)慢慢滴加到搅拌的溶液1中,反应15分钟,25℃下反应2小时,点板确定反应结束(具体反应时间以点板时间为准)。过滤除去白色沉淀,用30mlthf洗涤沉淀并过滤,合并滤液,旋蒸除去thf,得到大量白色固体,用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤,抽滤,重复洗涤3次,获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中,25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中,滴加完毕后反应继续反应1小时,反应结束(以点板为准)。用稀柠檬酸调ph值到7,旋蒸除去thf,再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间,得到大量白色沉淀,过滤,用稀柠檬酸500ml打浆洗涤,过滤,重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体,纯度:98.7%。

(5)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome的合成

溶液1:称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-oh、110毫摩的hosu,置于500ml的圆底烧瓶中,加入200mlthf溶解,磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。

溶液2:称取110毫摩的dcc,置于小烧杯中,用100ml的thf溶解,冷却至0-5℃备用

溶液3:称取110毫摩的nh2-leu-ome,溶于100ml的thf中,室温下备用

在0-5℃下,将dcc溶液(溶液2)慢慢滴加到搅拌的溶液1中,反应15分钟,25℃下反应2小时,点板确定反应结束(具体反应时间以点板时间为准)。过滤除去白色沉淀,用30mlthf洗涤沉淀并过滤,合并滤液,旋蒸除去thf,得到大量白色固体,用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤,抽滤,重复洗涤3次,获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中,25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中,滴加完毕后反应继续反应1小时,反应结束(以点板为准)。旋蒸除去thf溶剂,得到大量白色沉淀,用1.5升乙酸乙酯溶解,用饱和碳酸氢钠洗涤,重复洗涤500ml*3,用稀柠檬酸洗涤,重复洗涤500ml*3,用饱和食盐水洗涤500ml*3,干燥后旋蒸除去乙酸乙酯,获得大量白色固体,纯度:98.8%。

二、fmoc-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂的合成

2.1、第一个氨基酸偶联

2.1.1向反应釜中,加入200mmol的wang树脂和6ldmf,搅拌10-15分钟,抽滤除去液体;再加入6ldcm,氮气保护下搅拌溶胀25~35分钟,抽滤除去液体。

2.1.2称取400mmolfmoc-leu-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。加入甲醇进行封端,封端结束后,抽滤除去反应液,洗涤树脂,检测树脂的替代度,按照替代度进行下一步投料。

2.2、第二个氨基酸偶联

2.2.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.2.2偶联

称取400mmolfmoc-cys(trt)-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.3、第三个氨基酸偶联

2.3.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.3.2偶联

称取400mmolfmoc-gly-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.4、第四个氨基酸偶联

2.4.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.4.2偶联

称取400mmolfmoc-thr(tbu)-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.5、第五个氨基酸偶联

2.5.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.5.2偶联

称取400mmolfmoc-cys(mmt)-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.6、第六个氨基酸偶联

2.6.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.6.2偶联

称取400mmolfmoc-ala-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.7、第七个氨基酸偶联

2.7.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.7.2偶联

称取400mmolfmoc-val-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.8、第八个氨基酸偶联

2.8.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.8.2偶联

称取400mmolfmoc-asn-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.9、第八个氨基酸偶联

2.9.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.9.2偶联

称取400mmolfmoc-val-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

2.10、第八个氨基酸偶联

2.10.1去保护

向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。

去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

2.10.2偶联

称取400mmolfmoc-cys(trt)-oh,400mmolhobt,用5l的dmf溶解,溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒,控制温度在0~10℃,缓慢加入66ml的dic,控制温度在0~10℃,活化反应10~15分钟。活化反应完成后,将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气,20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体,洗涤树脂。

三、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-

asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂的合成

3.1去保护

称取fmoc-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-

wang树脂100mmol,向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应5~7min,抽除反应液,抽干3~5min。

再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液,加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应8~12min,抽除反应液,抽干3~5min。去保护后洗涤6次

每次量取dmf5l加入主反应釜,通氮气并搅拌洗涤3~5min,抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。

3.2偶联

称取100mmol的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome,1mmol的木瓜蛋白酶,nh2-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂100mmol,溶于dmf:硼酸氢氧化钠溶液=98.5:1.5中,反应时间为3小时。监测反应完全后结束反应,反应结束后抽滤除去反应液体,用dmf洗涤树脂,获得浅棕色多肽树脂。

四、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-

asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide的合成

称取boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂100毫摩,向计量罐中加入1-5%的tfa/dcm溶液5l作为反应液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应40分钟,抽除反应液,抽干反应液,用dmf洗涤1次,再次向计量罐中加入1-5%的tfa/dcm溶液5l作为反应液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应60分钟,抽除反应液,用dcm洗涤3次。向计量罐中加入dmf与h2o2溶液5l作为反应液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃,反应3小时,抽除反应液,用dcm洗涤3次,反应结束,得到boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide产品。

五、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-

val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)(7-15)bis(disulfide)的合成

称取boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide化合物100毫摩,向计量罐中加入i2/dmf溶液5l作为反应液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃,反应30分钟,抽除反应液,抽干反应液,用dmf洗涤1次,再次向计量罐中加入i2/dmf溶液5l作为反应液,主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃,反应2小时,抽除反应液,抽干反应液,用dmf洗涤3次,反应结束,得到目标产物。

六、nh2-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-

leu-oh-cyclic(4→12)(7-15)-bis(disulfide)的制备

将100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-

val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)(7-15)bis(disulfide)置于1000毫升的反应瓶中,用edt:tis:h2o:tfa=3:1:1:95比例的裂解液500毫升进行裂解,室温下裂解2-4小时,过滤除去树脂得到肽溶液,将其倒入到5升的冰无水乙醚中,产生大量白色沉淀,离心分离,冰无水乙醚洗涤3-6次,获得固体。粗品色谱图参照图1;之后,用0.1%的tfa水溶液和乙腈做纯化体系,用c18柱做纯化设备,旋蒸冻干后获得纯度为99.79%的高纯产品71.22g,总收率达到42.34%。纯品色谱图参照图2;质谱确认分子量为1681.88,做质谱之前用乙腈和水做除盐,甲醇做溶剂进行质谱确认。质普图参照图3。

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