本发明为多肽合成制备领域，特别涉及普利卡那肽的合成制备方法。
技术背景
普利卡那肽结构式如下：
h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)
普利卡那肽由美国synergy公司研发成功，并于2017年1月19日获得fda的批准，该药是一种口服鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂，可以在上消化道发挥作用以刺激分泌肠液，从而维持肠道功能正常。其氨基酸肽序为h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh，其中序列的4号位与10号位，7号位与15号位分别形成两对二硫环。主要用于治疗便秘肠易激综合症(ibs-c)和慢性特发性便秘(cic)，它是迄今第二个用于治疗便秘的口服多肽药物。当前关于该药物的合成专利不多，主要有深圳翰宇药业的cn201310209459.8和cn201310680490.x两个专利，以及南京工业大学的一个制备专利cn201510104385.0。深圳翰宇药业的两个专利分别采用不同的固液相合成策略，虽然都采用的不同的侧链保护剂，定向合成了两对二硫键，但是由于采用了最后液相环化的方法，合成反应液的浓度受到极大限制，会产生大量的废水，操作复杂麻烦，不适合产业化生产。南京工业大学采用了固相环化的方法，有所改进，但是纯固相合成，需要高倍数物料投入，产生大量原材料的浪费，原子利用率极差，反应时间相对较长。本发明收率基本与现有文献报道持平或略高于报道，但是总体时间成本，物料成本等大大降低，并且适用于工业化生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的普利卡那肽的固相合成方法，该方法合成效率高，物料成本大大降低，并且适用于工业化生产。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种普利卡那肽的固相合成方法，其特点是：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
本发明所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案步骤是：
a、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：
(1)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3的合成；
（2）利用树脂的假稀释效应完成r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-
cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)-disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(3)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
各类氨基酸保护基中：
r为z、boc、cl-z、fmoc、onbs、dnbs、troc、dts、pnz、onz、nvoc、nppoc、hfa、ddz、bpoc、nps、nsc、bsmoc、α-nsmoc、ivdde、fmoc*、mtt、alloc其中任意一个；
r1为meb、mob、trt、tmob、mmt、xan、pmbf、bn、tbu、fm、dnpe、fmoc、acm、phacm、stbu、npys、alloc其中任意一个；
r2为h、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb其中任意一个；
r3为h、ome、oet、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb、wang树脂、ctc树脂其中任意一个；
r4为bn、chx、tbu、trt、tbdms、dmnb、poc其中任意一个；
b、普利卡那肽粗肽的合成；
h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)
c、普利卡那肽的纯化和冻干。
本发明中的相关名词解释如下：
本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：固相合成过程中用到的偶联体系为：
（1）、单一缩合剂：dic、edc、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、tbtu、pybop、hbtu、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；
（2）二体系缩合剂：dic/hobt、edc/hobt、dic/hosu、edc/hosu；
（3）环合试剂：哌啶/dmf、h2o2/dmf、i2/dmf、dmso/dmf、h2o2/h2o、i2/h2o、dmso/h2o；
本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-
val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：
（1）以fmoc-leu-oh为第一个氨基酸，与wang树脂或ctc树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8mmol/g进行缩合形成fmoc-leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-r3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；
（2）、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)，disulfide的合成
采用4号位、12号位mmt或者acm保护的半胱氨酸，用不同浓度的tfa进行裂解，脱除mmt或者acm后，用dmso、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；
（3）、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成
采用7号位、15号位trt、tmob、pmbf或者acm保护的半胱氨酸，用i2/dmf进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；
（4）h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-
leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成
采用不同比例的tfa进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：tis、edt、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等，tfa的比例大于90%。
本发明中，木瓜蛋白酶不仅可以催化该反应，对其余各类酰胺键合成都有效果，氨基酸范围包括所有20种常规氨基酸。偶联过程中，所使用的dmf:硼酸氢氧化钠（或氢氧化钾）范围为90:10~99:1；dmf:磷酸二氢钠范围为92:8~99:1，其中，硼酸氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液范围为0.5%~20%，磷酸二氢钠范围为1%~13%。
与现有技术相比，本发明方法由于液相、固相同时开展合成，酶促合成大大提高了合成效率及合成收率，不仅极大的减少了废水、废有机溶剂、废气的产生，同时固液相合成大大降低了生产成本，提高了产品品质。
附图说明
图1为实施例所制得普利卡那肽粗品hplc图；
图2为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品hplc图；
图3为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品质谱图。
具体实施方式
以下参照附图，以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种普利卡那肽的固相合成方法，先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
实施例2，实施例1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其具体步骤是：
a、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：
(1)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3的合成；
（2）利用树脂的假稀释效应完成r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-
cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)-disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(3)r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
各类氨基酸保护基中：
r为z、boc、cl-z、fmoc、onbs、dnbs、troc、dts、pnz、onz、nvoc、nppoc、hfa、ddz、bpoc、nps、nsc、bsmoc、α-nsmoc、ivdde、fmoc*、mtt、alloc其中任意一个；
r1为meb、mob、trt、tmob、mmt、xan、pmbf、bn、tbu、fm、dnpe、fmoc、acm、phacm、stbu、npys、alloc其中任意一个；
r2为h、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb其中任意一个；
r3为h、ome、oet、otbu、bn、chx、mpe、2-ph1pr、tegbn、damb、al、pnb、ptmse、dmnb、wang树脂、ctc树脂其中任意一个；
r4为bn、chx、tbu、trt、tbdms、dmnb、poc其中任意一个；
b、普利卡那肽粗肽的合成；
c、普利卡那肽的纯化和冻干。
固相合成过程中用到的偶联体系为：
（1）、单一缩合剂：dic、edc、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、tbtu、pybop、hbtu、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；
（2）二体系缩合剂：dic/hobt、edc/hobt、dic/hosu、edc/hosu；
（3）环合试剂：哌啶/dmf、h2o2/dmf、i2/dmf、dmso/dmf、h2o2/h2o、i2/h2o、dmso/h2o；
实施例3，实施例1或2所述的一种普利卡那肽的固相合成方法中：
r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-
val-asn(r1)-val-ala-cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：
（1）以fmoc-leu-oh为第一个氨基酸，与wang树脂或ctc树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8mmol/g进行缩合形成fmoc-leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-r3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；
（2）、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12)，disulfide的合成
采用4号位、12号位mmt或者acm保护的半胱氨酸，用不同浓度的tfa进行裂解，脱除mmt或者acm后，用dmso、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；
（3）、r-asn(r1)-asp(r2)-glu(r2)-cys(r1)-glu(r2)-leu-cys(r1)-val-asn(r1)-val-ala-
cys(r1)-thr(r4)-gly-cys(r1)-leu-r3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成
采用7号位、15号位trt、tmob、pmbf或者acm保护的半胱氨酸，用i2/dmf进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；
（4）h-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-
leu-oh-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成
采用不同比例的tfa进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：tis、edt、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等，tfa的比例大于90%。
实施例4，一种普利卡那肽的固相合成方法方法实验：
一、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome的合成
(1)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-oh的合成
溶液1：称取100毫摩的boc-asn(trt)-oh、110毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的nh2-asp(otbu)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.2%
(2)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-oh的合成
溶液1：称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-oh、110毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的nh2-glu(otbu)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.1%。
(3)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-oh的合成
溶液1：称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-oh、110毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的nh2-cys(mmt)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.3%。
(4)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-oh的合成
溶液1：称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-oh、110毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的nh2-glu(otbu)-oh，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调ph值到7，旋蒸除去thf，再次用稀柠檬酸调ph值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.7%。
(5)、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome的合成
溶液1：称取100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-oh、110毫摩的hosu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlthf溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的dcc，置于小烧杯中，用100ml的thf溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取110毫摩的nh2-leu-ome，溶于100ml的thf中，室温下备用
在0-5℃下，将dcc溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlthf洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去thf，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlthf中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。旋蒸除去thf溶剂，得到大量白色沉淀，用1.5升乙酸乙酯溶解，用饱和碳酸氢钠洗涤，重复洗涤500ml*3，用稀柠檬酸洗涤，重复洗涤500ml*3，用饱和食盐水洗涤500ml*3，干燥后旋蒸除去乙酸乙酯，获得大量白色固体，纯度：98.8%。
二、fmoc-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂的合成
2.1、第一个氨基酸偶联
2.1.1向反应釜中，加入200mmol的wang树脂和6ldmf，搅拌10-15分钟，抽滤除去液体；再加入6ldcm，氮气保护下搅拌溶胀25~35分钟，抽滤除去液体。
2.1.2称取400mmolfmoc-leu-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。加入甲醇进行封端，封端结束后，抽滤除去反应液，洗涤树脂，检测树脂的替代度，按照替代度进行下一步投料。
2.2、第二个氨基酸偶联
2.2.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.2.2偶联
称取400mmolfmoc-cys(trt)-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.3、第三个氨基酸偶联
2.3.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.3.2偶联
称取400mmolfmoc-gly-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.4、第四个氨基酸偶联
2.4.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.4.2偶联
称取400mmolfmoc-thr(tbu)-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.5、第五个氨基酸偶联
2.5.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.5.2偶联
称取400mmolfmoc-cys(mmt)-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.6、第六个氨基酸偶联
2.6.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.6.2偶联
称取400mmolfmoc-ala-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.7、第七个氨基酸偶联
2.7.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.7.2偶联
称取400mmolfmoc-val-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.8、第八个氨基酸偶联
2.8.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.8.2偶联
称取400mmolfmoc-asn-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.9、第八个氨基酸偶联
2.9.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.9.2偶联
称取400mmolfmoc-val-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.10、第八个氨基酸偶联
2.10.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.10.2偶联
称取400mmolfmoc-cys(trt)-oh，400mmolhobt，用5l的dmf溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66ml的dic，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
三、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-
asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂的合成
3.1去保护
称取fmoc-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-
wang树脂100mmol，向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7min，抽除反应液，抽干3~5min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/dmf溶液5l作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12min，抽除反应液，抽干3~5min。去保护后洗涤6次
每次量取dmf5l加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
3.2偶联
称取100mmol的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-ome，1mmol的木瓜蛋白酶，nh2-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂100mmol，溶于dmf:硼酸氢氧化钠溶液=98.5:1.5中，反应时间为3小时。监测反应完全后结束反应，反应结束后抽滤除去反应液体，用dmf洗涤树脂，获得浅棕色多肽树脂。
四、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-
asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide的合成
称取boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(mmt)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(mmt)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang树脂100毫摩，向计量罐中加入1-5%的tfa/dcm溶液5l作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应40分钟，抽除反应液，抽干反应液，用dmf洗涤1次，再次向计量罐中加入1-5%的tfa/dcm溶液5l作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应60分钟，抽除反应液，用dcm洗涤3次。向计量罐中加入dmf与h2o2溶液5l作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应3小时，抽除反应液，用dcm洗涤3次，反应结束，得到boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide产品。
五、boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-
val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)(7-15)bis(disulfide)的合成
称取boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)disulfide化合物100毫摩，向计量罐中加入i2/dmf溶液5l作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应30分钟，抽除反应液，抽干反应液，用dmf洗涤1次，再次向计量罐中加入i2/dmf溶液5l作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应2小时，抽除反应液，抽干反应液，用dmf洗涤3次，反应结束，得到目标产物。
六、nh2-asn-asp-glu-cys(1)-glu-leu-cys(2)-val-asn-val-ala-cys(1)-thr-gly-cys(2)-
leu-oh-cyclic(4→12)(7-15)-bis(disulfide)的制备
将100毫摩的boc-asn(trt)-asp(otbu)-glu(otbu)-cys(1)-glu(otbu)-leu-cys(trt)-
val-asn(trt)-val-ala-cys(1)-thr(r4)-gly-cys(trt)-leu-wang-cyclic(4→12)(7-15)bis(disulfide)置于1000毫升的反应瓶中，用edt：tis:h2o：tfa=3:1:1:95比例的裂解液500毫升进行裂解，室温下裂解2-4小时，过滤除去树脂得到肽溶液，将其倒入到5升的冰无水乙醚中，产生大量白色沉淀，离心分离，冰无水乙醚洗涤3-6次，获得固体。粗品色谱图参照图1；之后，用0.1%的tfa水溶液和乙腈做纯化体系，用c18柱做纯化设备，旋蒸冻干后获得纯度为99.79%的高纯产品71.22g，总收率达到42.34%。纯品色谱图参照图2；质谱确认分子量为1681.88，做质谱之前用乙腈和水做除盐，甲醇做溶剂进行质谱确认。质普图参照图3。