本发明涉及一种铁皮石斛的提取方法，特别是一种多糖提取率高的铁皮石斛的提取方法。
背景技术：
铁皮石斛别称铁皮兰、吊兰、云南铁皮、铁皮吊兰，是兰科石斛属多年生草本植物，铁皮石斛是石斛类药材的上品，素有“中华仙草-药中黄金”之美称，以茎入药，含有多糖、石斛碱、生物碱等有效成分，具有滋阴清热、生津益胃、润喉明目等功效，在抗肿瘤、提高人体免疫力、治疗胃肠道疾病、抗衰老、抗氧化、抗血小板聚集、降低血糖、治疗白内障等方面均有良好疗效。
现代药理学研究表明，铁皮石斛对非特异性及特异性免疫均有增强作用，在抗肿瘤、抗氧化、降低血糖以及白内障的治疗等方面，药理作用显著。铁皮石斛的药效作用主要是因为其含有多种活性成分，如生物碱、多糖、氨基酸等，但各种活性成分的功效却不尽相同。而铁皮石斛在临床上应用主要通过将铁皮石斛药材熬制汤药服用起作用，各活性成分的功效并未得到针对性的应用，所以铁皮石斛的利用主要还停留在低端的初级阶段，其药用价值还需进一步开发。研究表明铁皮石斛多糖含量较高，多糖的抗氧化作用明显，具有良好的潜在开发价值。如果将其多糖进行提取后再利用对铁皮石斛的进一步开发具有重要意义。
目前对铁皮石斛多糖的提取方法有热水法，酶联合提取法和超声波法等。以上方法各有优点，但总的来说各种方法还有一定的局限性，多糖提取率低，一般在30%以下，限制了铁皮石斛多糖活性成分的开发利用。
技术实现要素：
本发明的目的，是提供一种铁皮石斛的提取工艺，本发明工艺对铁皮石斛进行提取时，多糖提取率高，促进了对铁皮石斛多糖的开发利用。
本发明是这样实现的：一种提取率高的铁皮石斛的提取方法，①初提取：取新鲜石斛茎，粉碎，过10-20目筛，加6-8倍量水，搅拌均散，煎煮20-30min，趁热过滤，滤渣重复煎煮2-3次，合并滤液，装瓶后置-25--20℃条件下冷冻24-48h，再进行冷冻干燥，得干燥提取物，粉碎，得A品；
②二次提取：A品置于恒温水浴锅中加热回流提取，趁热过滤，滤渣重复提取3-4次，合并滤液，滤液浓缩成50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏干燥至恒重，即得干膏提取物。
前述的提取率高的铁皮石斛的提取方法中，步骤①为；取新鲜石斛茎，粉碎，过10-20目筛，加7倍量水，搅拌均散，煎煮25min，趁热过滤，滤渣重复煎煮3次，合并滤液，装瓶后置-25--20℃条件下冷冻36h，再进行冷冻干燥，得干燥提取物，粉碎，得A品；
前述的提取率高的铁皮石斛的提取方法中，步骤②中，加热回流提取时，提取温度为80℃。
前述的提取率高的铁皮石斛的提取方法中，步骤②中，加热回流提取时，提取时间为90-120min。
前述的提取率高的铁皮石斛的提取方法中，步骤②中，加热回流提取时，料液比为1:35-45。
前述的提取率高的铁皮石斛的提取方法中，所述的料液比为1:40。
申请人对本发明进行了大量的实验研究，部分实验如下：
实验例 单因素考察
申请人对二次提取时，加热回流提取的参数进行了大量的研究，具体见表1。
由表得出：
①提取温度对铁皮石斛多糖提取率的影响: 多糖提取率在80℃下最高，此后逐渐下降。温度过高会导致多糖部分分解，因此最佳提取温度为80℃。
②提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响: 多糖提取率随提取时间延长而逐渐提高，在90-120min达到最高，最佳提取时间为90min。
③料液比对铁皮石斛多糖提取率的影响: 多糖提取率随溶剂用量的增多而逐渐提高，料液比在1:40时多糖提取率最高。因此最佳料液比为1:40。
④提取次数对铁皮石斛多糖提取率的影响: 多糖提取率随提取次数增多而逐渐提高，提取4次时提取率最高。因此最佳提取次数为4次。
实施例2 多糖纯度考察
1 材料
取重量相同的铁皮石斛3份，分别按下述方法制成提取物1、提取物2和提取物3。
提取物1：按实施例1进行提取。
提取物2：铁皮石加水煎煮4次，每次35min，煎煮液合并，过滤，提取液浓缩至50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏在50-60℃下烘干至恒重，即得。
提取物3：铁皮石斛加7倍量乙醇提取3次，每次2h，提取液合并，过滤，提取液浓缩至50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏在50-60℃下烘干至恒重，即得。
仪器和试剂
葡萄糖标准品[D一(+ )一葡萄糖]：KAYON 公司；甲醇(色谱纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯；苯酚：上海凌峰化学试剂有限公司；硫酸：上海凌峰化学试剂有限公司。
2 方法
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1供试品溶液1的制备：
取提取物1 ，粉碎，过三号筛，取过滤后粉末1.5g，挥干溶剂，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入 95%乙醇，摇匀，冷藏 1小时，取出，离心20分钟，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液1。
2.1.2供试品溶液2的制备
取提取物2 ，粉碎，过三号筛，取过滤后粉末1.5g，挥干溶剂，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入 95%乙醇，摇匀，冷藏 1小时，取出，离心20分钟，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液2。
2.1.3 供试品溶液的制备
取提取物3，粉碎，过三号筛，取过滤后粉末1.5g，挥干溶剂，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入 95%乙醇，摇匀，冷藏 1小时，取出，离心20分钟，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液3。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水制成 99 mg/L溶液，备用。
2.3 标准曲线制备
精密量取对照品溶液 0．2 、0．4 、0．6 、0．8 、1．0 m L 置 10m L 具塞试管中，加水至1.0mL，精密加入5％苯酚溶液1mL(I临用前现配制)，摇匀，再精密加入硫酸 5 m L，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，放入冰水浴中冷却5分钟，以相应的试剂为空白，在488 nm波长处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，浓度X (g/L)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y = 11．772X -0.1492 ，r = 0.9995 。结果表明多糖在0.02-0.10 g/L 范围内线性关系良好。
2.4 测定法
分别精密量取供试品溶液1、供试品溶液2和供试品溶液3各0.5 mL，置10 mL具塞试管中，加水至1mL ，按“2.3”标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1m L”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。
2.5 精密度试验
精密吸取葡萄糖对照品溶液6份，每份0.6 m L ，按照“2.4”项下的方法测定吸光度。测定结果，RSD分别为1.60%和1.62%，精密度良好。
2.6 重复性试验
按上述方法制备6份供试品溶液1、供试品溶液2和供试品溶液3，照按上述方法测定吸光度。测定结果，RSD分别为2.70%和2.71%，重复性良好。
2.7 稳定性试验
分别取同一供试品溶液1、供试品溶液2和供试品溶液3，在室温下放置，分别于10min、30min 、1 h、2 h、4 h、6 h 后按上述方法、供试品溶液2和供试品溶液3均在6小时内稳定。
2.8 加样回收率试验
称取提取物1粉末6份，每份约1.65g ，精密称定。准确加入葡萄糖对照品溶液(浓度为0.099 g/L )2 mL，按上述方法制备供试品溶液1，按上述方法测定，计算多糖含量，结果平均回收率为94.9%，RSD为2.7%。
称取提取物2粉末6份，每份约1.65g ，精密称定。准确加入葡萄糖对照品溶液(浓度为0.099 g/L )2 mL，按上述方法制备供试品溶液2，按上述方法测定，计算多糖含量，结果平均回收率为93.9%，RSD为2.6%。
称取提取物3粉末6份，每份约1.65g ，精密称定。准确加入葡萄糖对照品溶液(浓度为0.099 g/L )2 mL，按上述方法制备供试品溶液3，按上述方法测定，计算多糖含量，结果平均回收率为93.8%，RSD为2.6%。
2.9 样品测定
按上述供试品溶液1、供试品溶液2和供试品溶液3的制备方法和测定条件，测定6份提取物1样品和6份铁皮石斛2样品中多糖的含量，记录结果，结果取平均值，结果见表1。
由表可知，本发明工艺对铁皮石斛进提取时，每克提取物中含889.23g多糖，多糖纯度为88.9%，而提取物2和提取物3中的多糖纯度分别为64.4%和64.0%。
与现有技术相比，本发明工艺对铁皮石斛进行提取时，提取率高，且多糖纯度高达88.9%。
具体实施方式
实施例1。
一种提取率高的铁皮石斛的提取方法，包括：
①初提取：取新鲜石斛茎，粉碎，过10-20目筛，加7倍量水，搅拌均散，煎煮25min，趁热过滤，滤渣重复煎煮3次，合并滤液，装瓶后置-25--20℃条件下冷冻36h，再进行冷冻干燥，得干燥提取物，粉碎，得A品；
②二次提取：A品置于恒温水浴锅中加热回流提取，趁热过滤，滤渣重复提取4次，合并滤液，滤液浓缩成50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏干燥至恒重，即得干膏提取物。
步骤②中，加热回流提取时，提取温度为80℃；提取时间为90min；料液比为1:40。
实施例2。
一种提取率高的铁皮石斛的提取方法，包括：
①初提取：取新鲜石斛茎，粉碎，过10-20目筛，加8倍量水，搅拌均散，煎煮30min，趁热过滤，滤渣重复煎煮3次，合并滤液，装瓶后置-25--20℃条件下冷冻48h，再进行冷冻干燥，得干燥提取物，粉碎，得A品；
②二次提取：A品置于恒温水浴锅中加热回流提取，趁热过滤，滤渣重复提取4次，合并滤液，滤液浓缩成50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏干燥至恒重，即得干膏提取物。
步骤②中，加热回流提取时，提取温度为80℃；提取时间为120min；料液比为1:35。
实施例3。
一种提取率高的铁皮石斛的提取方法，包括：
①初提取：取新鲜石斛茎，粉碎，过10-20目筛，加6倍量水，搅拌均散，煎煮20min，趁热过滤，滤渣重复煎煮2次，合并滤液，装瓶后置-25--20℃条件下冷冻24h，再进行冷冻干燥，得干燥提取物，粉碎，得A品；
②二次提取：A品置于恒温水浴锅中加热回流提取，趁热过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，滤液浓缩成50-60℃时相对密度为1.1-1.2的稠膏，稠膏干燥至恒重，即得干膏提取物。
步骤②中，加热回流提取时，提取温度为80℃；提取时间为90min；料液比为1:45。