一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法与流程

本发明涉及多肽制备方法技术领域，具体涉及一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法。

背景技术：

糖尿病是由于遗传和环境因素相互作用，引起胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志。临床典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。而近年来，随着生活水平的提高，饮食结构变化，大多数人动少坐多等因素，导致全球糖尿病发病率增长迅速。其中，1型糖尿病患者占10％，2型糖尿病患者占90％。

利拉鲁肽(Liraglutide)是一种通过基因重组技术生产的GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，与天然的GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特性更适用于每天1次的给药方案。皮下注射给药后，其主要通过如下机理延长作用时间：一是通过自联作用使吸收减慢，二是与白蛋白结合，三是对DPP-Ⅳ和NEP具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。在2型糖尿病患者中，单次给予利拉鲁肽可以观察到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式增加。目前国内利拉鲁肽完全依赖进口，价格昂贵，因此迫切需要提供一种利拉鲁肽的制备方法，为广大糖尿病患者带来福音。

利拉鲁肽作为胰高血糖素肽(GLP-1)类似物的代表药物之一，在美国和欧洲地区，它作为2型糖尿病患者经二甲双胍单药或其他抗糖尿病口服药物治疗失败后的二三线药物使用。2013年版中国2型糖尿病防治指南中规定将胰高血糖素(GLP-1)类似物作为三线治疗药物使用。利拉鲁肽的多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。

利拉鲁肽结构式如下：

NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH

由以上结构式可知：利拉鲁肽分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20，是在天然GLP-1分子结构上将第34位的赖氨酸Lys改为精氨酸Arg，并在26位增加了1条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))侧链而得到的衍生物。

利拉鲁肽最早由诺和诺德公司开发研制，通过基因重组技术，利用酵母生产获得。现有技术中中间体多肽GLP-1(7-37)的合成方法主要采用化学合成，如专利CN104045706B公开了使用多种大量有机溶剂，对于环境不友好，且步骤繁琐不利于大规模工业放大；工艺杂质多；总收率仅18％。

另外涉及生物制备方法的专利CN104745597A中公开了表达方式为胞内可溶性表达，表达量较低，不利于工业化放大。专利CN104592381A中公开了包涵体溶解耗时过长，体积过大，使用大量的尿素；包涵体需要长时间复性并且复性蛋白浓度0.2g/L，复性所需体积过大，不利于工业放大。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的制备方法，通过基因重组技术，利用大肠杆菌发酵诱导表达获得Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)融合蛋白后，经过溶解、变复性、酶切、分离等操作获得高收率和高纯度的多肽GLP-1(7-37)，解决了现有技术中存在的杂质多、收率低、使用大量试剂对环境不友好，胞内可溶性表达导致表达量低，包涵体溶解和变复性时间长，蛋白浓度低导致变复性体积过大，不适合大规模生产，并限制了产能提升的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案，一种用于合成利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的融合蛋白Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，采用如下前导肽：

MATKAVSVLKGDGX1VQGIINFEQKESNGX2VKVWGSIKGLX3EGLHGFHVHKFVNQHLCGX4HLVALX5LV，

其中X1,X2：为P和Y中的任何一个氨基酸；

X3,X4和X5：为S,T和Y中的任何一个氨基酸。

本发明还提供了一种重组表达载体，包含编码所述融合蛋白的编码基因。

作为优选，所述重组表达载体，通过将所述编码基因克隆插入质粒载体pET-28a(+)中获得重组表达载体pET-28a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)。

本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的重组工程菌，采用所述的重组表达载体pET-28a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)转入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到。

本发明还提供了一种所述重组工程菌在重组利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)表达方面的应用。

本发明还提供了一种利用所述编码基因合成利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的方法，具体包括以下步骤：1)、合成编码上述融合蛋白Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)的编码基因；2)、将编码基因连接到表达载体中；3)、将带有编码基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；4)、重组工程菌发酵，诱导胞内不溶性包涵体形式的融合蛋白的表达，表达量高；所述融合蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；5)、将菌体破碎，收集包涵体、然后将包涵体经过洗涤和变复性；6)、酶切转化、分离纯化获得中间体多肽GLP-1(7-37)。

作为本发明的进一步改进，所述的步骤2)中编码基因与表达载体的连接方式为：通过Hind III/Nco I酶切位点插入到质粒载体pET-28a(+)相应酶切位点中。

作为本发明的进一步改进，所述步骤4)中重组工程菌的发酵采用高密度发酵，具体方式为：接种步骤3)所得到的重组工程菌，阳性克隆于100mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡过夜培养后，按照0.5-2.0％左右的比例接种于200mL LB培养基中，振荡培养至OD600值达到4-10时作为种子液，按照1-5％接种量接入6L的发酵培养基中进行高密度培养，初始发酵温度为37℃，搅拌速度为200rpm，通气量为40L/min，pH为6.5-7.3，之后不断提高搅拌速度和通气量以维持溶解氧始终在20％以上，等到底料培养基中碳源消耗完了，溶氧和pH会快速上升，开始流加补料，当菌体OD600值达到100以上加入IPTG经过8h诱导后，放罐。

作为本发明的进一步改进，所述步骤5)中将洗涤后的包涵体在pH为10-12的碱性条件下，按照重量体积比1:20-1:30，即蛋白浓度为20-30g/L加入包涵体溶解缓冲液，进行溶解变复性，缩小操作体积，降低试剂成本；溶解后就可以进行酶切，变复性时间很短不超过1h，缩短工艺时间，提高GLP-1(7-37)的收率。

作为本发明的进一步改进，所述步骤6)中所述酶切转化、分离纯化的具体方式为：步骤5)变复性后的融合蛋白经肠激酶(1:40g/U)在37℃下酶解16-24h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液，混合液使用UniSP-50XS阳离子交换分离即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品。UniSP-50XS阳离子交换纯化条件：缓冲液A：5-10‰HAc，pH 3.0-4.0，缓冲液B：0.5-2mol/L NaCl+5-10‰HAc，pH4.0-6.0，缓冲液C：25-100mmol/L PB+0.5-2.0mol/L NaCl+20-30％IPA，pH 5.0-7.0，缓冲液B和缓冲液C等梯度纯化与洗脱。

纯化后的利拉鲁肽中间体多肽HPLC纯度可以达到87％以上，用于侧链的修饰。纯化后的多肽经HPLC-MASS鉴定分子量为3383Da，为正确的利拉鲁肽中间体多肽的分子量。

本发明相对现有技术，具有以下优势：(1)通过改变重组序列信号肽，构建Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)融合蛋白，表达方式变为胞内不溶性包涵体表达，表达量大大增加；(2)洗涤后的包涵体采用碱溶，无需使用大量的变性剂，按照重量体积比1:20-1:30，即蛋白浓度为20-30g/L的高浓度加入包涵体溶解缓冲液，变复性时间大大缩短不超过1h，溶解后既可以酶切；减少了工序，缩小操作体积，降低试剂成本，利于工业化放大；(3)采用UniSP-50XS阳离子交换分离纯化，分离度高，纯化效果好，杂质少，操作简单。本发明制备的利拉鲁肽中间体多肽纯度达到87％以上，收率大于85％。

附图说明

图1是实施例1中重组质粒的构建图。

图2是实施例2中发酵过程中菌体生长曲线图。

图3是实施例4中酶切后混合液UniSP-50XS阳离子纯化图。

图4是实施例4中UniSP-50XS阳离子交换洗脱峰的HPLC谱图。

图5是实施例4中中间体多肽质谱图。

具体实施例方式

为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1重组工程菌的构建

利用常规的化学合成方法合成Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)融合蛋白的基因，将获得的序列cDNA通过Hind III/Nco I酶切位点插入到质粒pET-28a(+)相应酶切位点中，构建成的重组质粒如图1所示，插入编码Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)融合蛋白基因的重组质粒通过常规的化学转化法转入到宿主大肠杆菌中。

实施例2高密度发酵

接种实施例1所得的重组工程菌阳性克隆于100mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡过夜培养后，按0.5％的比例接种于200mL LB培养基中，振荡培养至OD600值达到10时作为种子液，按照1％接种量接入6L的发酵培养基中进行高密度培养。初始发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量40L/min，pH为6.5，之后不断提高搅拌转速与通气量最大分别为1000rpm和80L/min以维持溶解氧始终在20％以上，因为高密度发酵需要大量的氧气，如供氧不足，不仅会抑制菌体的呼吸作用，限制菌体的生长繁殖，而且会积累有害物质对菌体产生毒害作用，降低表达量。当溶氧和pH快速上升时，开始流加补料。当发酵液OD600值超过100时加入IPTG进行诱导并添加有机氮源，诱导8h后放罐。放罐后离心得菌体213g/L。发酵过程中菌体生长曲线图如图2所示。

本实施例的培养基配方及pH调节剂如下：

LB培养基：葡糖糖10g/L；酵母粉：15g/L；氯化钠10g/L；

发酵培养基：磷酸氢二铵4g/L；氯化铵5g/L；磷酸二氢钾10g/L；七水硫酸镁5g/L；一水合柠檬酸2g/L；酵母粉10g/L；一水葡萄糖10g/L；VB1微量元素10mL/L；

补料葡萄糖溶液：一水葡萄糖600g/L；硫酸镁25g/L；

诱导后有机氮源：酵母粉300g/L；

pH调节剂：磷酸；氨水。

实施例3高密度发酵

接种实施例1所得的重组工程菌阳性克隆于100mL LB培养基中，37℃，250rpm振荡过夜培养后，按2％的比例接种于200mL LB培养基中，振荡培养至OD600值达到4时作为种子液，按照5％接种量接入6L的发酵培养基中进行高密度培养。初始发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量40L/min，pH为7.3，之后不断提高搅拌转速与通气量最大分别为1000rpm和80L/min以维持溶解氧始终在20％以上，因为高密度发酵需要大量的氧气，如供氧不足，不仅会抑制菌体的呼吸作用，限制菌体的生长繁殖，而且会积累有害物质对菌体产生毒害作用，降低表达量。当溶氧和pH快速上升时，开始流加补料。当发酵液OD600值超过100时加入IPTG进行诱导并添加有机氮源，诱导8h后放罐。放罐后离心得菌体210g/L。

本实施例的培养基配方及pH调节剂同实施例2。

实施例4中间体多肽的纯化

将实施例2所得的发酵液放罐后离心收集菌体，按照重量体积比1:10加入破碎缓冲液，高压均质机900bar压力下破碎2遍，离心收集包涵体沉淀，包涵体湿重为25g/L发酵液。将沉淀按重量体积比1:5加入洗涤缓冲液，室温搅拌1h，离心收集的沉淀用洗涤液洗涤1次。将洗涤后的包涵体按照重量体积比1:20(即蛋白浓度为20g/L)加入包涵体溶解缓冲液，pH调为10.0，溶解1h进行变复性。溶解后的包涵体调节pH为8.0后直接加入肠激酶(1：40g/U)，在37℃下酶解16h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液。混合液使用UniSP-50XS阳离子交换即可获得纯度为90.5％的中间体多肽样品。UniSP-50XS阳离子交换纯化条件：缓冲液A平衡层析柱1-3CV后进行上样；0.25g样品上样完成后，用缓冲液B进行洗杂3-8CV，洗出的为洗杂峰；最后用缓冲液C进行洗脱5-10CV，在洗脱峰前端和末端中目的峰的纯度不高，洗脱峰中间是高纯度的目的蛋白峰，如图3所示。取洗脱峰样品进行HPLC和质谱检测，HPLC检测洗脱时间为14.914min的目的蛋白的纯度为90.5％，HPLC图谱如图4所示，收集到的目的蛋白为0.22g，收率为88.0％；质谱检测出目的蛋白的分子量为3383.29Da，和利拉鲁肽多肽中间体分子量一致，如图5所示。

本实施例所用的各种缓冲液配方如下：

破碎缓冲液：50mmol/L Tis+5mmol/L EDTA，pH7.0；

洗涤缓冲液：2mol/L尿素+50mmol/L Tis+2.0％Triton；

包涵体溶解缓冲液：50mmol/L Tris+10mmol/L EDTA，pH 12.0；

缓冲液A：5‰HAc，pH 3.5；

缓冲液B：0.5mol/L NaCl+5‰HAc，pH 5.0；

缓冲液C：50mmol/L PB+1mol/L NaCl+25％IPA，pH 6.0。

本实施例所用的仪器检测条件为：

HPLC条件：柱温40℃；流速0.5mL/min；压力限值400.0bar；检测波长214nm。

质谱条件：离子源电压3.5Kv；Gas Temp 300℃；Drying Gas3.0L/min；Nebulizer 15psig；碰撞气体N2；检测方式为正离子模式。

实施例5中间体多肽的纯化

将实施例3所得的发酵液放罐后离心收集菌体，按照重量体积比1:10加入破碎缓冲液，高压均质机900bar压力下破碎2遍，离心收集包涵体沉淀，包涵体湿重为25g/L发酵液。将沉淀按重量体积比1:5加入洗涤缓冲液，室温搅拌1h，离心收集的沉淀用洗涤液洗涤1次。将洗涤后的包涵体按照重量体积比1:30(即蛋白浓度为30g/L)加入包涵体溶解缓冲液，调pH为12.0，溶解1h进行变复性。溶解后的包涵体调节pH为9.0后直接加入肠激酶(1：40g/U)，在37℃下酶解24h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液。UniSP-50XS阳离子交换纯化条件：缓冲液A平衡层析柱1-3CV后进行上样；0.28g样品上样完成后，用缓冲液B进行洗杂3-8CV，洗出的为洗杂峰；最后用缓冲液C进行洗脱5-10CV，在洗脱峰前端和末端中目的峰的纯度不高，洗脱峰是高纯度的目的蛋白。取洗脱峰样品进行HPLC和质谱检测，HPLC检测目的蛋白的纯度为87.3％和收集到的目的蛋白为0.24g，纯化收率为85.7％；质谱检测出目的蛋白的分子量和利拉鲁肽多肽中间体分子量一致。

本实施例所用的各种缓冲液配方如下：

破碎缓冲液：50mmol/L Tis+5mmol/L EDTA，pH 7.0；

洗涤缓冲液：2mol/L尿素+50mmol/L Tis+2.0％Triton；

包涵体溶解缓冲液：40mmol/L Tris+10mmol/L EDTA，pH 10.0；

缓冲液A：10‰HAc，pH 4.0；

缓冲液B：1.0mol/L NaCl+5‰HAc，pH 4.5；

缓冲液C：100mmol/L PB+1.0mol/L NaCl+30％IPA，pH 6.5。

本实施例所用的仪器检测条件同实施例4。

序列表

<110> 美药星（南京）制药有限公司

<120> 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Thr Lys Ala Val Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Xaa Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Xaa Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Xaa Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Xaa His Leu Val Ala Leu

50 55 60

Xaa Leu Val Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser

65 70 75 80

Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala

85 90 95

Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

100