仿刺参F型凝集素AjFL-1、制备方法及应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种仿刺参F型凝集素AjFL-1、制备方法及应用。

背景技术：

仿刺参(Apostichopus japonicus) 营养价值高及含有多种有效抗癌活性成分，是我国北方黄渤海地区重要的经济海洋水产养殖品种之一。但是，由于海洋环境的日益恶化，高浓度的病原菌导致了海参养殖严重的病害问题，已制约了海参养殖业的健康发展。仿刺参在病害发生的过程中，机体免疫应答关键的第一步是病原和宿主免疫因子之间的识别，因仿刺参不具备获得性免疫系统，缺乏特异性免疫识别分子，因此模式识别分子PRM （Pattern Recognition Molecule）在免疫识别中起着极其重要的作用。F型凝集素是一类含有独特的F型折叠和岩藻糖结合基序的糖识别蛋白，通常也称为岩藻糖凝集素，具有一个CRD结构域。近几年，已在脊椎动物（主要在鱼类）中发现了越来越多的F型凝集素，可以作为免疫识别分子在鱼类免疫防御中扮演着重要角色。但是，迄今为止并没有关于仿刺参F型凝集素、制备方法及在制备抑制毕赤酵母菌药物中应用的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种仿刺参F型凝集素AjFL-1、制备方法及应用。

本发明的技术解决方案是：一种仿刺参F型凝集素AjFL-1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述仿刺参F型凝集素AjFL-1的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对仿刺参F型凝集素AjFL-1编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

b. 将PCR扩增产物与pET-22b（+）载体经Nde1和Xho1酶切后通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；

c. 将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白。

一种上述仿刺参F型凝集素AjFL-1在制备抑制毕赤酵母菌药物中的应用。

本发明利用体外重组表达技术获得了仿刺参F型凝集素AjFL-1，该重组蛋白能够优先结合L-岩藻糖，同时在机体外对毕赤酵母菌具有较强的抑制作用，且对不同PAMPs具有广谱性识别作用，在合成岩藻糖探针、制备广谱抗菌药物及免疫增强剂等具有应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例重组表达和纯化蛋白电泳图。

图2是本发明实施例仿刺参F型凝集素AjFL-1和不同PAMPs的结合活性示意图。

图3是本发明实施例仿刺参F型凝集素AjFL-1和不同菌的凝集活性示意图。

具体实施方式

本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 采用5′末端分别添加了Nde I和Xho I限制酶切位点的基因特异性引物P1和P2对仿刺参F型凝集素AjFL-1编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

反应条件为：首先94 °C预变性5分钟，然后进入下列循环：94 °C变性5min，94 °C变性30秒，55 °C退火40秒，72 °C延伸10分钟，共进行35个循环。用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用Nde I和Xho I对质粒进行双酶切；回收目的片段，即得到PCR扩增产物。

b. 将PCR扩增产物与pET-22b（+）载体（Novagen公司产品）经Nde1和Xho1酶切后通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；

c. 将构建好的重组质粒转化至表达宿主菌大肠杆菌Transetta（DE3）中并筛选阳性克隆。挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，37 °C培养至OD600 = 0.4~0.8。加入IPTG（终浓度1m mol L^-1），继续培养4小时后于4 °C 5000 rpm离心10分钟，收集菌体，于-80 °C冻存备用。取1 ml菌液离心，弃去上清后，加入80 μl水和20 μl的 5×蛋白上样缓冲液，100 °C煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。

本发明的重组蛋白在变性条件下采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱（1.6×20 cm），柱床体积为10 ml；

（2）用缓冲液I（50 mmol L^-1 Tris-HCl，0.5 mol L^-1 NaCl，pH 7.2）平衡2~5个柱床体积，流速为2 ml min^-1；

（3）所收集的菌体用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000 rpm，4 °C离心30分钟，上清液用0.45 μm滤膜过滤后，过柱，流速为1 ml min^-1；

（4）用缓冲液I再洗2~5个床体积，流速为2 ml min^-1；

（5）用含有50 mmol L^-1咪唑的缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2 ml min^-1；

（6）用400 mmol L^-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集；

（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；

（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2 mL min^-1，柱子置于4 °C环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2 mM的还原谷胱甘肽、0.2 mM氧化谷胱甘肽、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6 M逐渐替换到4 M、3 M、2 M、1M、0 M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4 °C透析12 h，即得到仿刺参AjFL-1基因重组蛋白。

SDS-PAGE电泳结果如图1所示。图1中：M是Marker，1是未经诱导的重组蛋白，2是诱导后的重组蛋白，3是纯化后的重组蛋白。

所得重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

长度：165个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

特性：分子量为20 kDa，具有一个保守的CRD结构域。

来源：仿刺参

所得纯化重组蛋白鉴定为F型凝集素，命名为仿刺参F型凝集素AjFL-1。

实验例1：

本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1与不同PAMPs（LPS、PGN、Mannan和Fucose）的结合活性检测，具体步骤如下：

(1)用包被液（50 mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH 9.8）将不同的 PAMPs稀释至100 μg mL^-1，按每孔100 μL加入96孔酶标板中，4 °C条件下包被过夜；

(2)TBST洗3次，每次5 min；

(3)每孔中加入200 μL 3% BSA 溶液（用TBST溶解），37 °C培养箱中封闭1 h；

(4)TBST洗3次，每次5 min；

(5)本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1按两倍浓度梯度稀释后，每孔100 μL（每种梯度设置3个平行，TBST作为空白对照，标签蛋白Trx作为阴性对照），18 °C孵育3 h；

(6)TBST洗3次，每次5 min；

(7)根据制备的多克隆抗体效价，用3% BSA溶液将一抗按1:500的比例稀释后，取100 μL加至酶标板中，37 °C孵育1 h；

(8)TBST 洗3次，每次5min；

(9)用3% BSA溶液将二抗（HRP 标记）按1:1000的比例稀释后，取100 μL加至酶标板中，37 °C孵育1 h；

(10)TBST洗3次，每次5 min；

(11)每孔加入100 μL TMB发色液，显色15~30 min后加入50 μL 4 M的浓硫酸溶液终止后，酶标仪读取OD405值；

(12)数据分析：将实验组OD405值（P）/阴性对照组OD405值（N）> 2.1视为阳性结果，即能与PAMP结合；

实验结果如图2所示：本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1对四种PAMP都有很强的结合活性且呈现剂量依赖性。其中对Fucose和Mannan结合活性最强，在浓度最低7.8125 μg mL^-1时，优先结合Fucose。

实验例2：

本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1与不同菌（P. pastoris、V. splendidus、E. coli、M. luteus）的凝集活性检测。大肠杆菌（Escherichia coli Top10，购自北京天根生化科技有限公司），灿烂弧菌（Vibrio splendidus，购自北京微生物菌种保藏中心），毕赤酵母（Pichia pastoris GS115，购自Invitrogen），藤黄微球菌（Micrococcus luteus，购自北京微生物菌种保藏中心）。具体步骤如下：

(1)FITC染色：5000 rpm离心5 min收集菌体。弃去培养基后，加入 TBS 缓冲液，重复清洗菌体三次。加入 FITC（终浓度 0.1mg ml^-1），置暗处染色 30 min。5000 rpm离心5 min收集菌体。弃去上清后，加入TBS缓冲液，重复清洗菌体三次，以彻底去除残留的 FITC。

(2)凝菌实验：使用TBS缓冲液（50 mmol L^-1 Tris-HCl, 50 mmol L^-1 NaCl，pH 8.0）将FITC标记的菌重悬，使其浓度达到 2.5×10⁹cell ml^-1。在离心管中，取10 μl菌悬液，与25 μl本发明仿刺参F型凝集素AjFL-1混匀。在对照组中，取10 μl与25 μl rTRX（pET-22b（+）空载体表达蛋白）混匀。室温下孵育1 h后，取10 μl在荧光显微镜下观察。

实验结果如图3所示：本发明的仿刺参F型凝集素AjFL-1显示较强凝集毕赤酵母的活性，同时凝集灿烂弧菌和大肠杆菌。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 仿刺参F型凝集素AjFL-1、制备方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 仿刺参(Apostichopus japonicus)

<400> 1

Met Gln Thr Cys Asp Asn Gly Gln Leu Thr Ser Val Thr Leu Cys Thr

1 5 10 15

His Asn Val Ala Ala Gly Lys Glu Thr Thr Gln His Ser Thr Tyr Asn

20 25 30

Gln Asp Gly Lys Ser Glu Asn Ala Val Asn Gly Asn Thr Ser Gly Tyr

35 40 45

Trp Gly Thr Arg Ser Cys Thr Gly Thr Leu Trp Ala Thr Asn Pro Trp

50 55 60

Trp Ser Val Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Gly Ser Ile His Ile

65 70 75 80

Tyr Asn Arg Val Glu Gly Thr Leu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala Gln

85 90 95

Val Leu Ala Gly Thr Ala Ala Asp Pro Leu Ala Asn Glu Val Ile Gly

100 105 110

Thr Ile Gly Ser Glu Glu Leu Leu Asp Asn Pro Ile Val Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Thr Val Thr His Val Ser Val Arg Leu Pro Gly Asn Lys Lys

130 135 140

Leu Leu Thr Leu Cys Gly Val Glu Val Tyr Gly Val Pro Leu Glu His

145 150 155 160

His His His His His

165

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Apostichopus japonicus)

<400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Apostichopus japonicus)

<400> 3