一种能高效诱导血管组织新生的多肽及其用途的制作方法

本发明属于医用生物材料领域，尤其涉及一种能高效诱导血管组织新生的多肽及其用途。

背景技术：

人工血管移植是临床上治疗血管性疾病的主要手段。因具有优良的生物相容性、适宜的力学性能和可调控的降解速率，人工复合材料在血管支架材料研究领域得到越来越多的关注。但是简单的人工复合材料其自发诱导血管组织新生的能力很弱。因此。对人工复合材料进行功能化修饰以赋予其优异的促血管新生的能力仍然是必需的。

目前，一些多肽(如WKYMVm、SP及CAG等)已被证明具有诱导血管组织新生的能力。因此，现有技术中也有将这些多肽与人工复合材料结合以实现对其进行修饰，再来植入以实现快速血管化。然而，目前采用多肽对人工复合材料进行修饰的方法主要存在以下技术问题：一方面，多肽对人工复合材料的亲和性差，形成的结合不稳定、结合力小、结合率低，进入人体内后，多肽会很快脱落、流失、降解掉，另一方面，进行修饰所需要的条件不利于维护多肽的生物活性，在修饰反应过程中，多肽的促血管新生能力会大大减弱甚至丧失。对此，目前现有技术中，主要采用一些起桥梁作用的多肽，将其先与上述多肽反应以实现将二者结合，之后再用所制得的多肽产品对人工复合材料进行修饰，以改善人工复合材料的促血管新生能力。然而，这一方法依然存在以下技术难题：1、两种多肽之间具有较高的相互选择性，若选择不好，则会导致二者在功能上相互抑制，进而导致与人工复合材料无法结合或结合不稳定，或者在结合后无法发挥促生长作用。2、多肽产品与人工复合材料选择搭配不好，也会阻碍多肽的促生长功能的发挥，致使多肽产品无法赋予人工复合材料以理想的诱导血管新生的能力。3、制备多肽产品的反应过程，以及多肽产品对人工复合材料的修饰过程，都分别需要通过复杂的化学反应实现。在制备反应过程中若控制不好，则既会导致所得的多肽产品的促血管新生能力大大减弱甚至丧失，也会导致多肽产品对人工复合材料的亲和性差，形成的结合不稳定、结合力小、结合率低，进入人体体内后，会很快脱落、流失、降解掉的难题。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种能高效诱导血管组织新生的多肽，该多肽对特定的人工复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，能快速、高效且稳定的与特定的人工复合材料进行非共价结合，进而一步式地实现对人工复合材料的修饰，并使其具有明显促进血管新生的生物功能。

本发明的另一目的在于提供上述能高效诱导血管组织新生的多肽的用途。

本发明的第一目的具体通过以下技术方案来实现：

一种能高效诱导血管组织新生的多肽，其特征在于，多肽序列如下：SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2，其中，SCNSSSYSWYCWFGGSSPS为PGA-binding peptide motif短肽序列，它对人工复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，WKYMVm-NH2可促进血管形成。

作为进一步明确，上述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽，具体是通过以下步骤制备得到的：

1、称取1000～5000mg FMOC-RINK AMIDE MBHA RESIN树脂置于多肽合成反应器的反应柱中，向其中加入二氯甲烷(DCM)浸没树脂，保持30min使树脂膨胀以达到活化树脂的目的，之后压滤除去DCM；

2、加入15ml六氢吡啶，氮气吹沸反应5min，压滤除去六氢吡啶，之后再次加入15mL六氢吡啶，氮气吹沸反应15min，压滤除去六氢吡啶，先后分别使用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂各三次，每次15毫升；

3、向1000～1500mg FMOC-D-MET-OH、500～1000mg O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中，先后依次加入0.8～2ml 1-羟基苯并三唑(HOBt)、10～20ml DMF、0.1～1ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)配成反应液，再将该反应液加入反应柱中并于室温环境下用氮气吹沸反应3h；反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次；FMOC-D-MET-OH连接到树脂后，取浓度为1moI/l的乙酸酐和0.3moI/l乙胺各2ml加入15ml DMF中，混和均匀，加入连有第一个氨基酸的树脂复合物中，氮气吹沸充分反应120～150min以封闭树脂上的活性位点；

4、依次重复第2、3步骤各一次，直至接到最后一个氨基酸Fmoc-Ser-OH；

5、最后分别用DMF、DCM、甲醇各洗三次收干树脂；

6、用氮气将所得的树脂复合物吹干，加入50ml烧瓶中，随后加入体积比为80：5：5：5：3：2的三氟乙酸(TFA)/苯酚/水/苯硫基甲烷/1,2-乙二硫醇(EDT)/三异丙基硅烷(TIS)的混合溶液，于0～5℃下密闭磁力搅拌反应3～5h后，经砂芯漏斗过滤入20～30倍体积量的冰乙醚中，放置冰箱2h；离心收集沉淀，沉淀用超纯水溶解，再放置冰箱冷冻；然后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至恒重即得粗肽；所得的粗肽经质谱仪检测和高效液相色谱仪分离纯化。

此外，本发明中与所述多肽进行结合的人工复合材料为聚已内酯(PCL)/聚卡普隆(PGC)纳米复合材料，其制备方式为：

(1)取聚已内酯(PCL)和聚卡普隆(PGC)溶于六氟异丙醇(HFIP)中，以制备聚合物纺丝溶液，其中各组分重量含量为：PCL 6％～8％，PGC 2％～5％，其余为HFIP；

(2)将所得聚合物纺丝溶液在电压为15kV，注射速率为1.0ml/h，注射器针头内径为0.8mm，收集装置(即滚筒)与注射器针头的间距为15cm，滚筒转速为250rpm的条件下，采用静电纺丝仪制备成PCL/PGC纳米复合材料。所制得的PCL/PGC纳米复合材料的平均直径为415.507±88.150nm。

作为再进一步明确，上述多肽与上述人工复合材料进行结合的过程为：将所述PCL/PGC纳米复合材料经体积比为75％的酒精浸泡和紫外辐照杀菌后，采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲溶液)漂洗3次，之后再浸泡于浓度为50～500μmol/L的所述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽溶液中，于4℃无菌环境中静置1～24h，其后再经PBS缓冲溶液漂洗3次以除去未粘附的多肽分子而制得的。其中，上述多肽溶液是向所述多肽中先后加入适量的无菌三蒸水和PBS缓冲溶液配制而成的。

本发明还提供了上述能高效诱导血管组织新生的多肽在制备用于治疗骨缺损疾病的医用材料中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种能高效诱导血管组织新生的多肽，该多肽对用作制备人工血管材料的PCL/PGC纳米复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，能快速、高效且稳定的与PCL/PGC纳米复合材料进行非共价结合，进而一步式地实现对人工复合材料的修饰，简化了反应步骤，同时避免了其在复杂化学反应中减弱甚至丧失其促血管形成的能力，并保证了其具有明显促进血管新生的生物功能。该多肽合成简单、周期短、易提纯、纯度高(纯度达>95％)、合成价格低廉，且相对于其他多肽分子，对PCL/PGC纳米复合材料具有很高的亲和性，在4℃环境下，2h内即可与PCL/PGC纳米复合材料进行快速、高效的非共价结合，而无需通过复杂、耗时的化学反应过程，因此，该多肽在修饰PCL/PGC纳米复合材料方面更快更简单更高效；

此外，该多肽与PCL/PGC纳米复合材料选择搭配性好，所得人工骨移植材料在临界骨缺损模型中，体现了促进血管化和骨缺损修复的优异性能：在临界骨缺损模型中植入该材料1月后，骨缺损区域出现大量微血管；植入2月后，骨缺损区域出现了明显的骨组织再生和骨缺损修复的现象，且其治疗无副作用、生物安全，解决了人工骨移植材料在促骨缺损修复过程中难以血管化的问题。

附图说明

图1为本发明实施例中所述人工骨移植材料的构造示意图。

图2为本发明实施例中所述多肽序列的结构示意图。

图3为本发明实施例中所得PCL/PGC纳米复合材料的SEM示意图。

图4为本发明实施例中所述PCL/PGC纳米复合材料经本发明中的多肽修饰后其表面化学元素变化的XPS检测图。

图5为本发明实施例中所述PCL/PGC纳米复合材料与经本发明中所述多肽修饰后的PCL/PGC纳米复合材料(PCL/PGC-W纳米材料)，分别诱导血管新生能力的效果对比图。

图6为本发明实施例中将所述人工骨移植材料植入骨缺损处1月后，对缺损组织区域行冰冻切片，其后对冰冻切片进行免疫组织荧光染色，最后在荧光显微镜下观察到的缺损处血管新生的效果图。

图7为本发明实施例中将所述人工骨移植材料植入骨缺损处2月后缺损处的micro-CT图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

一种人工骨移植材料，其结构示意图见附图1，它由聚已内酯(PCL)/聚卡普隆(PGC)纳米复合材料与序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽构建而成；所述多肽，其结构示意图见附图2，且其中SCNSSSYSWYCWFGGSSPS为PGA-binding peptide motif短肽序列，它对作为人工骨材料的PCL/PGC纳米复合材料有很高的选择性和很强的亲和性，WKYMVm-NH2可促进血管形成。

上述PGA-binding peptide motif短肽序列，在期刊：Annals of Biomedical Engineering,Vol.38,No.6,June 2010，pp.1965–1976，文章名：Peptide Interfacial Biomaterials Improve Endothelial Cell Adhesion and Spreading on Synthetic Polyglycolic Acid Materials，作者：Xin Huang,Stefan Zauscher等的文章中，已明确公开其作为桥梁肽的应用。

其PCL/PGC纳米复合材料，具体是通过以下步骤制备得到的：

称取0.45g聚已内酯(PCL)和0.15g聚卡普隆(PGC)固体颗粒，并加入透明玻璃瓶，向玻璃瓶中加入6ml六氟异丙醇(HFIP)并持续搅拌3天以制备稳定、均匀的聚合物纺丝溶液；将配制好的聚合物纺丝溶液在电压为15kV，注射速率为1.0ml/h，注射器针头内径为0.8mm，收集装置(即滚筒)与注射器针头的间距为15cm，滚筒转速为250rpm的工作条件下，采用静电纺丝仪制备成PCL/PGC纳米纤维；所得PCL/PGC纳米纤维置于通风处7天以充分挥发有机溶剂。

将所制得的PCL/PGC纳米复合材料经喷金处理3次/每次10s，采用钨灯丝扫描电子显微镜检测其表面形貌，再将所得电镜图片通过Image J软件(National Institutes of Health美国)分析可知，参见附图3中所示，本发明中的PCL/PGC纳米复合材料为直径为100-500nm的纤维，具有与骨组织中天然细胞外基质相仿的结构和形貌；经测算其平均直径为415.507±88.150nm。图3中所示分别为：(A)FESEM下PCL/PGC纳米复合材料的形貌；(B)PCL/PGC纳米复合材料的直径分布。

该序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽，具体是通过以下步骤制备得到的：

1、称取1000～5000mg FMOC-RINK AMIDE MBHA RESIN(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：GL-F1907)树脂置于多肽合成反应器的反应柱中，向其中加入二氯甲烷(DCM)浸没树脂，保持30min使树脂膨胀以达到活化树脂的目的，之后压滤除去DCM；

2、加入15ml六氢吡啶，氮气吹沸反应5min，压滤除去六氢吡啶，之后再次加入15mL六氢吡啶，氮气吹沸反应15min，压滤除去六氢吡啶，先后分别使用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂各三次，每次15毫升；

3、向1000～1500mg FMOC-D-MET-OH(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：35602)、500～1000mg O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：00705)中，先后依次加入0.8～2ml 1-羟基苯并三唑(HOBt)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：00602)、10～20ml DMF、0.1～1ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：90600)配成反应液，再将该反应液加入反应柱中并于室温环境下用氮气吹沸反应3h；反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂两次，然后用DMF洗涤树脂三次；FMOC-D-MET-OH连接到树脂后，取浓度为1moI/l的乙酸酐和o.3moI/l乙胺各2ml加入15ml DMF中，混和均匀，加入连有第一个氨基酸的树脂复合物中，氮气吹沸充分反应120～150min以封闭树脂上的活性位点。

4、依次重复第2、3步骤各一次，直至接到最后一个氨基酸Fmoc-Ser-OH(其购进来源为：吉尔生化(上海)有限公司，货号是：36101)；

5、最后分别用DMF、DCM、甲醇各洗三次收干树脂；

6、用氮气将所得的树脂复合物吹干，加入50ml烧瓶中，随后加入体积比为80：5：5：5：3：2的三氟乙酸(TFA)/苯酚/水/苯硫基甲烷/1,2-乙二硫醇(EDT)/三异丙基硅烷(TIS)的混合溶液，于0～5℃下密闭磁力搅拌反应3～5h后，经砂芯漏斗过滤入20～30倍体积量的冰乙醚中，放置冰箱2h；离心收集沉淀，沉淀用超纯水溶解，再放置冰箱冷冻；然后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至恒重即得粗肽；所得的粗肽经质谱仪检测和高效液相色谱仪分离纯化。

上述人工骨移植材料,也即经所述多肽修饰后的PCL/PGC纳米复合材料(PCL/PGC-W纳米复合材料)，是将所述PCL/PGC纳米复合材料裁成圆形薄膜(直径为6μm)置于96孔板，

经体积比为75％的酒精浸泡和紫外辐照1h杀菌后，采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲溶液)漂洗3次，之后再浸泡于浓度为100μmol/L的所述序列为SCNSSSYSWYCWFGGSSPSWKYMVm-NH2的多肽溶液中，使薄膜完全被多肽溶液浸没，于4℃无菌环境中静置2h，2h后吸弃多肽溶液，再经PBS缓冲溶液漂洗3次，每次5min，以除去未粘附的多肽分子而制得的。其中，多肽溶液是将所述多肽粉末先后用适量的无菌三蒸水和PBS缓冲溶液配制而成的浓度为100μM的溶液。

根据图4可知：在未经本发明中多肽修饰的PCL/PGC纳米复合材料表面未检测到N元素，而在经本发明中多肽修饰的PCL/PGC纳米复合材料表面检测到N元素，这说明本发明中的多肽与PCL/PGC纳米复合材料成功地进行了快速、高效的非共价结合，而无需通过复杂、耗时的化学反应过程。

本发明进行了以下体外血管新生的实验：

大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)经密度梯度离心法分离，使用EGM-2/MV培养基，5％FBS，37℃，5％二氧化碳，95％相对湿度条件下进行诱导培养。P1-P2代EPCs用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，终止消化后用PBS溶液离心洗涤2次(1200rpm×5min)以除去血清。离心后的细胞用无血清的EGM-2/MV培养基重悬，按5×10⁴细胞/孔的密度接种到预铺200μL Matrigel基质胶的24孔板中。之后向孔中放入分别预置的PCL/PGC纳米复合材料、PCL/PGC-W纳米复合材料的transwell小室，同时使材料均浸没于100μL无血清的培养基中。该24孔板置于37℃，5％二氧化碳，95％相对湿度条件下继续培养12h后在光学显微镜下(4x)观察各孔血管样结构形成情况并拍照记录，其所得效果对比图参见附图5。图5中(A)为内皮祖细胞(EPCs)在含有未经本发明中所述多肽修饰的PCL/PGC纳米复合材料的无血清培养基中培养12h后，EPCs形成血管样结构图；(B)为内皮祖细胞(EPCs)在含有经本发明中所述多肽修饰后的PCL/PGC纳米复合材料的无血清培养基中培养12h后，EPCs形成血管样结构图。

根据附图5可知：单一的PCL/PGC纳米复合材料(对照组)，其自发诱导血管组织新生的能力很弱，而经本发明中所述多肽修饰后的PCL/PGC纳米复合材料组则有更多、更明显的血管样结构形成，说明了它可明显有效促进血管组织新生，因此，对PCL/PGC纳米复合材料进行功能化修饰以赋予其优异的促血管新生的能力仍然是必需的。另一方面，也可以看出PCL/PGC纳米复合材料与本发明中的多肽，二者之间的相互选择配合性好，多肽中WKYMVm的促生长生物功能得以充分保护和发挥。因此，本发明中的多肽在修饰PCL/PGC纳米复合材料方面更稳定，在人工血管材料领域具有较好的临床应用潜力。

此外，本例中还应用了所制得PCL/PGC-多肽人工复合材料进行了以下检测实验：

(1)临界颅骨骨缺损模型的构建和移植材料的植入

购买6只8周龄的SD大鼠(220～250g)，具体手术操作为：首先按照1～1.5mL/只的剂量腹腔注射水合氯醛溶液(10wt％)麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后固定大鼠的四肢和头部。头部剃毛，并用碘伏进行局部消毒，铺洞巾。无菌条件下，用手术刀沿枕骨到额骨沿中线切开皮肤2cm，用镊子和手术刀片将贴在颅骨上的软组织分离，暴露颅骨。用环形电钻在大鼠左右两侧颅骨钻孔以各制备一个直径为5mm的全层颅骨缺损。钻孔过程中适当用生理盐水冷却，钻孔完毕用生理盐水冲洗以清除残留骨渣，于大鼠颅骨右侧缺损处植入本发明所制得的人工骨移植材料，最后依次缝合骨膜及头皮，碘伏消毒创口。术后当日及其后的两天注射20万单位青霉素以防感染。动物在清洁级动物房中进行单独分笼饲养，提供充足的食物和水。

(2)术后骨缺损处血管新生的检测

术后1月，腹腔过量注射水合氯醛溶液(20wt％)对2只大鼠进行无痛处死。切开皮肤，取出整个颅骨，用生理盐水漂洗干净后立即置于4％多聚甲醛中于4℃环境中固定24h。后在室温下用脱钙液脱钙7d，其后先后用PBS溶液和双蒸水洗涤颅骨组织终止脱钙。最后进行冰冻切片。所得切片进行通透15min处理后在37℃条件下用10％山羊封闭血清封闭30min，之后用50μL的一抗溶液anti-CD31(货号：ab119339，来源公司：Abcam)在4℃环境下孵育过夜，之后在37℃环境下与50μL的带FITC标记的山羊抗兔IgG溶液(货号：ab6717，来源公司：Abcam)结合，细胞核用DAPI溶液(货号：C1006，来源公司：碧云天)进行染色。切片最后在荧光显微镜下随机选取5个视野(10x)拍照。

根据图6所示的术后1月骨缺损处血管新生的荧光图像显示，可知：术后1月，植入本发明人工骨移植材料的骨缺损区有大量CD31+阳性表达细胞，表明该处有大量血管样组织，相比之下，未植入材料的骨缺损区CD31表达较弱，这表明植入本发明人工骨移植材料可显著促进缺损区血管新生。

(3)术后骨缺损修复效果的检测

术后2月，过量注射麻醉剂对剩余的4只大鼠进行无痛处死。切开皮肤，取出整个颅骨，用生理盐水漂洗干净后立即置于4％多聚甲醛中于4℃环境中固定24h。对固定好的大鼠颅骨标本使用Micro-computed tomography(Micro-CT)进行扫描和三维重建以检测其骨缺损修复情况。

根据图7可知：micro-CT显示在术后2月在4周时骨密度值(BMD)达到0.6937g/cm²，骨体积分数(BV/TV)达到34.4506％，显著高于未植入材料组，这表明本发明人工骨移植材料可显著促进骨组织再生和骨缺损修复。