螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，尤其涉及一种螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂。
背景技术：
：变应性鼻炎(allergicrhinitis，AR)是机体暴露于变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。国内外大量的流行病学调查显示，全球的AR患者超过5亿。AR已成为主要的呼吸道慢性炎性疾病，给患者生活质量和社会经济带来严重影响。面对如此高的患病率以及患者对生活质量改善的要求，临床上各种诊疗措施应运而生，鼻腔局部糖皮质激素、口服抗组胺药和白三烯受体阻滞剂是目前最主要的治疗方法，但只能控制症状。脱敏治疗可使70%左右的患者产生对相应过敏原的耐受，但脱敏周期长达3年以上，费用很高，而且要在医生观察下进行治疗，病人的依从性不高。螨在亚热带和热带地区最主要的螨为屋尘螨、粉尘螨等。屋尘螨以人类皮屑为食，并主要生活在床垫、床底、枕头、地毯、家具及绒毛玩具中。在热（20℃以上）且潮湿（相对湿度大于80%）的环境中繁殖最快。屋尘螨变应原包含在其排泄物颗粒中，当沾染的织物被碰动后，这些颗粒便暴露于空气中并能够很快再次沉积下来，螨作为室内的主要致敏原，螨抗原对气道上皮细胞和先天性免疫细胞有直接刺激，易引起过敏性鼻结膜炎和过敏性哮喘，并有助于特应性湿疹和其他过敏性皮肤病的产生。如果在局部施用针对具有酶活性变应原的抗体，其活性就会被削弱，就不能与IgE结合，过敏反应就不会发生。卵黄免疫球蛋白IgY是抗体的一种，是采用生物高科技从禽类卵黄中提取的免疫球蛋白，在结合效价及中和病毒、细菌、真菌及昆虫等抗原的能力方面，IgY与人类抗体相似，IgY会与相应病源微生物表面的抗原决定族特异性结合而抑制过敏反应的发生，这些病源微生物抗原被IgY结合后活性降低，而失去致病能力，被IgY结合的抗原很容易被人类免疫系统识别，并通过单核细胞等降解，因为IgY不会改变病源微生物的遗传物质和生物学特性，所以不会产生耐药性，IgY的这一特征使其在局部应用具有重要意义。而且，皮肤过敏患者亦可应用，受益人群非常广泛。因此，针对螨虫过敏原，亟需开发新的包括卵黄免疫球蛋白IgY的抗体。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提出了一种螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，用于治疗由螨变应原引起的过敏性鼻炎、过敏性鼻炎伴哮喘和过敏性皮炎等疾病。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：本发明提出了一种螨变应原特异性IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：螨变应原制备：选取纯化螨虫体，采用Coca’s液提取方法，制得螨变应原粗提物；免疫疫苗制备：将所述螨变应原粗提物溶解在0.1mol/L的PBS溶液中充分混匀，得到螨变应原溶液,其蛋白浓度为2mg/ml；吸取1-1.5ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅰ，按1:1的比例将弗氏完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅰ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅰ，作为首免疫苗；吸取2-3ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅱ，按1:1的比例将弗氏不完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅱ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅱ，作为强化免疫疫苗；对鸡进行强化免疫：吸取所述首免疫苗剂量200μl，分别在鸡的左右翅下各两处进行皮下注入进行首次免疫，然后每隔10天使用所述强化免疫疫苗强化免疫一次，共强化免疫四次；在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml，首次免疫和第一次强化免疫在产蛋前期进行；IgY抗体的提取：对收集的鸡蛋进行取蛋黄处理，1体积蛋黄加5-6体积的双蒸水，充分搅拌混合均匀后，调试pH至5-6，然后将其置于4℃静置8-10小时，冷冻离心15-30min，取上清液，获得粗提物；精提：在获得的粗提物中加入60%硫酸钠沉淀一次，再用14%硫酸钠溶液沉淀两次，取上清液进行超滤除菌、除离子获得精提物；纯化：通过纤维素对获得的精提物进行柱层析纯化，得到螨变应原特异性IgY抗体。进一步的，所述螨变应原粗提物包括：屋尘螨蛋白Derp1和Derp2、粉尘螨蛋白Derf1和Derf2。进一步的，所述纯化螨虫体通过如下方法获取：将螨虫接种至面粉培养基，将所述面粉培养基置入温度为25℃、相对湿度75%的恒温箱中培养4-6周，形成螨虫群落，将所述螨虫群落连同部分面粉培养基移入装有新鲜饲料的容器中继续培养4-6周，重复上述操作获得大量纯螨，将获得的大量纯螨移入整体螨培养基进一步繁殖，获得纯化螨虫体。进一步的，所述进行强化免疫的鸡为梅林鸡、海兰褐鸡和京红鸡中的一种。进一步的，所述进行强化免疫的鸡的鸡龄为120-150天，每只鸡为1.2-1.5kg。进一步的，在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并对经过强化免疫的鸡每6只抽取1只，在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml。进一步的，所述冷冻离心的速度为12000r/min。进一步的，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性鼻炎和过敏性鼻炎伴哮喘的药物中的用途。进一步的，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性皮炎的药物中的用途，所述过敏性皮炎包括痤疮。同时，提出了一种根据前面所述的螨变应原特异性IgY抗体制成的抗过敏制剂，按照重量百分含量计包括如下组分：螨变应原特异性IgY抗体或其粗提物0.15-2%；羟乙基纤维素0.5-1%；木糖醇0.5-1.0%；丙三醇1.0-2.0%；聚山梨酯800.3-0.5%；清凉醇0.1-0.3%；氯已定0.01-0.02%；双蒸水加至100%。本发明的有益效果至少包括：本发明螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，可达到引起过敏性鼻炎和过敏性哮喘主要致敏源的全覆盖，制得的抗体活性高、对螨引起的局部致敏有特异性的防御作用，对其它致敏原引起的局部致敏有良好的隔阻效应，无免疫原性，对人体皮肤黏膜无不良反应，安全性能高。附图说明图1为本发明螨变应原粗提物电泳图。图2为本发明螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白IgY抗体电泳图。图3为本发明螨变应原粗提物WesternBlot检测图。图4为本发明抗过敏制剂成膜试验检测图。图5为本发明抗过敏制剂动物表面皮肤和角膜过敏及毒性试验检测图。图6为本发明抗过敏制剂的1号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图7为本发明抗过敏制剂的2号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图8为本发明抗过敏制剂的3号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图9为本发明抗过敏制剂细菌阻隔试验图。其中：图1中，M为标准蛋白分子量，1为2、3和4三种变应原混合，2为本发明制备的螨变应原粗提物，3为阿罗格标准屋尘螨皮试抗原，包含Derp1和Derp2蛋白，4为阿罗格标准粉尘螨皮试抗原，包含Derf1和Derf2蛋白；图2中，M为标准蛋白分子量，A、B、C和D分别为：本发明重复试验获得的IgY抗体、本发明首次试验获得的IgY抗体、抗多种细菌抗体和空白对照；a、b、c和d分别为A、B、C和D对应抗体50℃水浴处理30分钟；图3中，1为2、3和4三种变应原混合，2为本发明制备的螨变应原粗提物，3为阿罗格标准屋尘螨皮试抗原，4为阿罗格标准粉尘螨皮试抗原；图4中，左侧分别为1号样品药物、2号样品药物和3号样品药物，右侧均为空白对照组；图5中，D为：上侧为对照组，下侧为1号样品药物实验组；E为：上侧为对照组，下侧为2号样品药物实验组；F为：上侧为对照组，下侧为3号样品药物实验组；图9中，G为空白对照组，H为1号样品药物，I为2号样品药物，J为3号样品药物。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下面将结合具体试验图对本发明所述的螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂进行具体阐述。本发明所述的螨变应原特异性IgY抗体的制备方法，具体包括以下步骤。一、螨变应原制备螨变应原提取物原料是来自于纯化螨虫体（其中包括>90%螨虫体、少许粪便和不同发育阶段螨），从卧室被褥、床垫、床底、屋角搜集的粉尘经过常规处理获得螨后，将螨虫接种至面粉培养基，将所述面粉培养基置入温度为25℃、相对湿度75%的恒温箱中培养4-6周，形成螨虫群落，将所述螨虫群落连同部分面粉培养基移入装有新鲜饲料的容器中继续培养4-6周，重复上述操作获得大量纯螨，将获得的大量纯螨移入整体螨培养基进一步繁殖，获得纯化螨虫体，再采用Coca’s液提取方法，制得螨变应原粗提物。根据本发明的一些实施例，所述容器的具体类型不受限制，优选为玻璃罐。本发明所述Coca’s液提取方法为本
技术领域：
常规的提取方法，主要包括：将本发明获得的纯化螨虫体依次进行灭活、去除脂蛋白、液氮反复冻融、碾磨、超声破碎、coca’s溶液抽提，获得螨变应原粗提物。图1为本发明螨变应原粗提物电泳图，参照图1所示，本发明所述螨变应原粗提物在分子量为34-26kDa之间、17kDa和25kDa附近显示蛋白条带，包含分子量为27kDa、15kDa屋尘螨主要蛋白Derp1和Derp2；以及25kDa、14kDa粉尘螨主要蛋白Derf1和Derf2。Derp1是屋尘螨蛋白，螨粪便中浓度高，属于木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族的一种主要过敏原。人体吸入Derp1后导致过敏性特应性个体中IgE抗体的产生，当再次吸入Derp1即发生以过敏性鼻炎为主的I型变态反应，和其同源的粉尘螨Derf1，由于其抗原决定簇与Derp1相同，二者有交叉反应。Derp2是螨虫体蛋白，重症哮喘患者更常见的是对Derp2和Derf2尘螨过敏，而儿童对Derp2比Derp1更敏感。本发明所述螨变应原粗提物同时采用Derp1、Derf1、Derp2和Derf2四种过敏原，即可基本达到过敏性鼻炎和过敏性哮喘主要致敏源的全覆盖。二、螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白IgY抗体制备1.免疫疫苗制备：将制备得到的所述螨变应原粗提物溶解在0.1mol/L的PBS溶液中充分混匀，得到螨变应原溶液,其蛋白浓度为2mg/ml；吸取1-1.5ml螨变应原溶液（即为抗原溶液），加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅰ，按1:1的比例将弗氏完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅰ中反复推打混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅰ，作为首免疫苗；吸取2-3ml螨变应原溶液（即为抗原溶液），加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅱ，按1:1的比例将弗氏不完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅱ中反复推打混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅱ，作为强化免疫疫苗。2.对鸡进行强化免疫：本发明优选为梅林鸡，鸡龄为120-150天，每只梅林鸡为1.2-1.5kg，收集免疫前的鸡蛋作为空白对照组。吸取所述首免疫苗剂量200μl，分4点皮下注入，分别在梅林鸡的左右翅下各两处进行皮下注入进行首次免疫，然后每隔10天使用所述强化免疫疫苗强化免疫一次，共强化免疫四次；在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的梅林鸡所产的鸡蛋，并对经过强化免疫的梅林鸡每6只抽取1只，在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml，首次免疫和第一次强化免疫在产蛋前期进行；所述空白对照组同时收集鸡蛋并采血。根据本发明的一些实施例，所述进行强化免疫的鸡还可以为海兰褐鸡或京红鸡等。3.螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白IgY抗体的提取：对收集的鸡蛋逐个检查，蛋壳有瑕疵、破损或颜色不鲜艳的剔除，进行取蛋黄处理，1体积蛋黄加5-6体积的双蒸水，充分搅拌混合均匀后，调试pH至5-6，pH优选为5.5；然后将其置于4℃静置8-10小时，优选为8小时；冷冻离心15-30min，优选为15min，所述冷冻离心的速度为12000r/min；取上清液，即为粗提物。4.精提：在获得的粗提物中加入60%硫酸钠沉淀一次，再用14%硫酸钠溶液沉淀两次，取上清液进行超滤除菌、除离子获得精提物。5.纯化：通过纤维素对获得的精提物进行柱层析纯化，得到螨变应原特异性IgY抗体，还得到其它蛋白包括转铁蛋白、溶菌酶等。根据本发明的一些实施例，本发明可以采用DEAE纤维素树脂作为离子交换剂，进行分离纯化。根据本发明的实施例，图2为本发明螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白IgY抗体电泳图，IgY是一种7s免疫球蛋白，由67-70kDa的重链和22-30kDa的轻链构成，螨变应原免疫鸡获得的鸡卵黄蛋白提取物（即为粗提物或精提物）电泳结果显示（如图2所示）：纯化IgY在分子量为55-72kDa之间显示一条主要的带，其分子量为68kDa的重链，26-34kDa之间显示一条较小的带，其分子量为28kDa的轻链。50℃水浴处理30分钟后蛋白性质稳定，表明本发明制备的螨变应原特异性IgY具有良好的热稳定性。根据本发明的实施例，图3为本发明螨变应原粗提物WesternBlot检测图，参照图3所示，本发明经蛋白质免疫印迹试验发现，四种抗原在分子量为17-34kDa处显示四条主要的带，并有拖尾，表明本发明制备的IgY抗体能与螨多种变应原蛋白特异性结合，是一种多克隆抗体。将本发明制备的IgY抗体进行ELISA检测，为常用的ELISA间接法，实验步骤主要包括：1.包被：将所用抗原用包被稀释液PBS1:100稀释包被；2.封闭：PBS溶液和牛血清白蛋白1:100封闭；3.加入待检测样品（本发明制备的IgY抗体样品）：加样100μl；4.加入酶标抗体：PBS溶液和辣根过氧化物酶（1:10000）标记的二抗驴抗鸡IgG；5.加底物液100μl；6.终止反应：加入终止液H2SO4，50μl；7.测OD值。ELISA检测结果显示，重复试验免疫血清效价为1:2048，首次试验免疫血清效价为1:1024，相应IgY抗体效价为1:2048～4096和1:1024，空白对照血清效价1:128，蛋白效价1:64，可知本发明制备的IgY抗体效价已达到临床应用的要求。根据本发明的一些实施例，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性鼻炎和过敏性鼻炎伴哮喘的药物中的用途。根据本发明的一些实施例，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性皮炎的药物中的用途，所述过敏性皮炎包括痤疮。同时，本发明提出了一种根据前面所述的螨变应原特异性IgY抗体制成的抗过敏制剂，按照重量百分含量计包括如下组分：螨变应原特异性IgY抗体或其粗提物0.15-2%；羟乙基纤维素0.5-1%；木糖醇0.5-1.0%；丙三醇1.0-2.0%；聚山梨酯800.3-0.5%；清凉醇0.1-0.3%；氯已定0.01-0.02%；双蒸水加至100%。纤维素是由通过β-(1→4)-糖苷键连接的D-脱水吡喃葡萄糖单元（AGU）组成的线性间列聚合的均聚物，羟乙基纤维素由于采用环氧乙烷修饰，取代了纤维素上的部分羟基，使其具有良好的水溶性，水溶液具有较高的粘度，可用作亲水凝胶及分散稳定剂等。在本制剂中利用其重复单元的功能对IgY起分散和稳定的作用，同时由于其粘度较高、良好的盐溶性、生物相容性和保持水分等性能，对黏膜具有一定的保护作用，并可延长IgY在局部的滞留时间。所述氯已定为表面活性剂，在本制剂中用于防腐；所述聚山梨酯80也是一种表面活性剂，在本制剂中起乳化和增溶的作用，其余成分构成保湿、调味、稳定体系。在pH为7-7.5的条件下室温保存半年，制剂仍然澄清，无沉淀。本发明还分别用羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素代替羟乙基纤维素进行制剂的制备，尽管这两种高分子材料均可作为药物辅料和分散剂，而且在理论上其分散能力比羟乙基纤维素强，但前者制备的溶液稍显混浊，后者有絮状物沉淀形成（吸附聚山梨酯80），最终采用0.5%羟乙基纤维素作为IgY制剂的分散剂，用于药物递送。本发明所述螨变应原特异性IgY抗体制成的抗过敏制剂（以下简称：抗螨变应原制剂）的性能检测。1.成膜试验：按上述配方制备1号样品药物（本发明所述抗螨变应原制剂），然后分别用羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素代替羟乙基纤维素制备出2号和3号样品药物，3号样品药物有絮状物沉淀，离心去除；分别取1、2、3号样品药物200ul，喷涂在6孔培养板上，室温下干燥后显微镜下观察，以PBS缓冲液作空白对照，结果只有1号样品药物形成粗糙均匀厚度适中的膜，而2、3号样品药物不够均匀，厚度不够，图4为本发明抗过敏制剂成膜试验检测图，参照图4所示。2.动物表面皮肤和角膜过敏及毒性试验：实验动物：裸鼠，为免疫缺陷的小鼠，容易感染，且皮肤毛发稀少，易于观察；实验方法：6周龄成熟裸鼠作为实验对象，分为D、E、F三组，其中，D为：上侧为对照组，下侧为1号样品药物实验组；E为：上侧为对照组，下侧为2号样品药物实验组；F为：上侧为对照组，下侧为3号样品药物实验组；所述上侧为对照组不予干预，下侧为实验组，分别给予1、2、3号样品药物。以左手固定小鼠，用实验药物喷在眶周皮肤及角膜上（需保证小鼠睁眼时快速喷洒），每侧一喷，间日给药，总共给药2周，约7-8次。观察裸鼠皮肤及角膜的变化。实验结果：于2017-07-19开始给药，2017-08-02最后一次给药，总共给药8次。未观察到实验组与对照组动物的皮肤及角膜有分泌物、皮疹、溃疡等改变；实验组前后裸鼠的皮肤及角膜的色彩、光泽度等均未观察到有明显的改变，图5为本发明抗过敏制剂动物表面皮肤和角膜过敏及毒性试验检测图，参照图5所示，表明本发明制剂体外应用安全。3.细胞毒性试验：实验分组：所述1,2,3号样品药物。每组药物设置3块板，观察0H，24H及48H的样品药物对239T细胞的抑制作用。实验方法：用MTT法检测药物对293T细胞系的抑制作用。取对数生长期的293T细胞，去上清液并用PBS溶液洗两遍，用胰酶消化后，用全培终止消化。细胞计数后种入96孔板，调整至每孔2000个细胞。5%CO2，37℃孵育24小时后，按照浓度梯度设置分别加入1,2,3号样品药物及对照组各10ul（各个浓度设置3个复孔）。即时测各组0H的药物抑制效果。分别每孔加入MTT10ul（2mg/ml）后5%CO2，37℃孵育4小时，去上清液，加入DMSO150ul。充分震荡后用酶标仪于OD490nm检测吸光度。同样方法检测药物作用24H，48H后的吸光度。所述浓度梯度设置（单位ul）如下：105210.50.20.10（本发明设置8组方便计算IC50），时间点检测分别为：0H，24H，48H。实验结果：图6-8分别为本发明抗过敏制剂的3组样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。参照图6-8拟合曲线所示，0H结果显示样品药物无明显作用，96孔板各孔细胞数量分布均匀。3组样品药物24H各浓度梯度对细胞均无明显抑制作用。48H结果可见3组药物均出现轻度抑制作用，表明本发明制剂低浓度应用是安全的。计算得各组药物的IC50如下：1号样品药物IC50:1.6(1.561-1.646)ul2号样品药物IC50:1.2(1.252-1.286)ul3号样品药物IC50:1.6(1.456-1.739)ul。4.微生物阻隔试验：分别用1、2、3号样品（使用0.22um过滤）密集涂布在细菌培养皿上，分别为100ul，200ul，300ul，和空白对照。风干后培养皿暴露于空气中6h，培养，计算菌落形成并拍照（图9中，G为空白对照组，H为1号样品药物，I为2号样品药物，J为3号样品药物）。细菌菌落计算：空白组G：25；1号H组100ul：25；200ul：18；300ul：14；2号I组100ul：20；200ul：19；300ul：13；3号J组100ul：16；200ul：6；300ul：18；结果显示，本发明1、2号样品药物随浓度增加有细菌隔阻作用，与空白对照比较差异有显著性（p<0.05)，而3号样品药物效果不稳定。发明人发现，本发明螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，可达到过敏性鼻炎和过敏性哮喘主要致敏源的全覆盖，制得的抗体活性高、对螨引起的局部致敏有特异性的防御作用，对其它致敏原引起的局部致敏有良好的隔阻效应，无免疫原性，对人体皮肤黏膜无不良反应，安全性能高。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页1 2 3