本发明属于生物成像的技术领域，特别涉及一种具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针及其制备方法与应用，光激活聚集诱导发光探针应用在生物成像领域。
背景技术：
光激活荧光成像，可通过光照控制实现高时空分辨荧光成像，在生物医学研究中发挥着日益重要的作用。为了实现光激活荧光成像，需克服以下难题：(1)传统荧光材料在高浓度聚集时，其荧光会发生明显的自我猝灭；(2)光激活化学反应种类有限，光激活效率低，而且在光激活过程中，会生成有毒副产物；(3)合成难度大，难以引入光响应基团和生物靶向基团；(4)不具备原位生成能力，难以长期保存，不利于存储、运输和使用。
聚集诱导发光材料作为新一代荧光材料，具有抗光漂白能力强、聚集态发光效率高、斯托克位移大、低毒性等优点，可有效克服聚集猝灭发光的缺陷，在生物成像和检测领域日益获得广泛应用，特别适用于细胞器的成像和生理功能探究。细胞器是细胞中功能独立的亚细胞结构，包括脂滴，溶酶体，线粒体，内质网，高尔基体等，在细胞的生理活动中扮演着极为重要的角色。例如，脂滴是细胞内脂类分子和蛋白质的重要贮存场所，溶酶体作为细胞内的“消化器官”，负责分解各种外源和内源的大分子物质。相较于直接染色细胞器的荧光探针，具有光激活能力的聚集诱导发光探针可以更好地用于研究细胞器的各项生理功能。为了便于在生物医学研究中广泛使用，迫切需要发展基于简单底物，在室温环境下，不需任何催化剂，直接原位高效生成光激活聚集诱导发光探针的方法，克服传统荧光材料的聚集猝灭发光、光激活效率低、生成有毒副产物、难以制备和保存等缺陷，实现对细胞器的特异性光激活成像和生理功能研究。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针。本发明的发光探针具有原位生成效率高、光激活效率高、信噪比高、细胞毒性小、斯托克位移大、进入细胞能力强、易于保存和使用等优点。本发明的荧光探针用于细胞器特异性的光激活荧光成像，具有非常好的效果。
本发明的另一目的在于提供上述具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针的应用。所述具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针在生物成像中的应用，特别是在细胞器特异性荧光成像中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针，其结构为式iii：
其中r、r1独立地为氢、卤素、酯基、氰基、硝基、取代或未取代的烷基、烷基氧基(r′-o-，r′烷基)、烷基氨基(r′-nh-，r′烷基)、烷基硫基(r′-s-，r′烷基)、芳基、杂芳基、芳基氧基(ar-o-)、芳基氨基(ar-nh-)、芳基硫基(ar-s-)、杂芳基氧基、杂芳基氨基、杂芳基硫基；
所述烷基为直链或支链烷基；所述取代烷基是指环状化合物所形成的基团取代烷基中的氢，环状化合物优选为由碳，氢与n、s、o杂原子中一种或多种所形成的环状化合物，更优选为吗啉；
所述烷基为c1-30烷基，烷基氧基为c1-30烷基氧基，烷基氨基为c1-30烷基氨基，烷基硫基为c1-30烷基硫基；
所述芳基指具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基、芘基；芳基氧基、芳基氨基和芳基硫基中的芳基各自独立的为具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基、芘基；
所述杂芳基指具有1-20个碳原子、1-4个选自n、s、o杂原子的单环或多环杂芳族基团，代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基；所述杂芳基氧基、杂芳基氨基和杂芳基硫基中杂芳基各自独立的为具有1-20个碳原子、1-4个选自n、s、o杂原子的单环或多环杂芳族基团，代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基。
优选地，当r为氢，r1不为氢也不为甲氧基。
一种具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针的制备方法，包括以下步骤：将式i化合物与式ii化合物反应，获得光激活聚集诱导发光探针；
所述光激活聚集诱导发光探针，其结构为式iii：
所述式i化合物为二(2-(2-羟基苄叉)氨基)芳基二硫类化合物，其结构为式i：
所述式ii化合物为硫醇，其结构为式ii：hs-r2(ii)
式i和式iii中r、r1独立地为氢、卤素、酯基、氰基、硝基、取代或未取代的烷基、烷基氧基(r′-o-，r′烷基)、烷基氨基(r′-nh-，r′烷基)、烷基硫基(r′-s-，r′烷基)、芳基、杂芳基、芳基氧基(ar-o-)、芳基氨基(ar-nh-)、芳基硫基(ar-s-)、杂芳基氧基、杂芳基氨基、杂芳基硫基；
所述烷基为直链或支链烷基；所述取代烷基是指环状化合物所形成的基团取代烷基中的氢，环状化合物优选为由碳，氢与n、s、o杂原子中一种或多种所形成的环状化合物，更优选为吗啉；
所述烷基为c1-30烷基，烷基氧基为c1-30烷基氧基，烷基氨基为c1-30烷基氨基，烷基硫基为c1-30烷基硫基；
所述芳基指具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基、芘基；
所述芳基氧基、芳基氨基和芳基硫基中的芳基各自独立的为具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基、芘基；
所述杂芳基指具有1-20个碳原子、1-4个选自n、s、o杂原子的单环或多环杂芳族基团，代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基；
杂芳基氧基、杂芳基氨基和杂芳基硫基中杂芳基各自独立的为具有1-20个碳原子、1-4个选自n、s、o杂原子的单环或多环杂芳族基团，碳与杂原子能够形成环状基团；代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基；
r2为取代或未取代的烷基、芳基；所述取代的烷基为羟基取代、酯基取代或羧基取代的烷基；羟基取代的烷基为烷基上的氢被羟基取代的基团，优选为-ch2-r3-oh，r3为亚烷基(直链或支链)；酯基取代的烷基为烷基上的碳被酯基取代的基团，优选为-r4-coo-r5，r4为亚烷基(直链或支链)，r5为烷基(直链或支链)；羧基取代的烷基为烷基上的碳被羧基取代的基团，优选为-r4-cooh，r4为亚烷基(直链或支链)；所述硫醇还可以为含有巯基的氨基酸、含有巯基的多肽。
所述烷基为直链或支链烷基；优选为c1-30烷基。
在上述制备方法中，所述反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中一种以上；
所述反应的温度为15～40℃，优选为室温，更优选为20～30℃；所述反应的时间为1～30min；所述式i化合物与式ii化合物的摩尔比为1:2～1:10。
所述式i化合物为二(2-(2-羟基苄叉)氨基)芳基二硫类化合物，其制备方法包括以下步骤：
(s1)将式v化合物溶于有机溶剂中，在20～60℃下，加入双氧水，生成式vi化合物；
(s2)在有机溶剂中，将式vi化合物和式vii化合物在催化剂的作用下回流反应，获得式i化合物；
式v化合物：
步骤s1中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜中一种以上；所述反应时间为1～30min；
步骤s1中所述式v化合物与双氧水的摩尔比为1:1～1:5，温度优选为30～50℃；步骤s2中所述回流反应的温度为50～80℃，回流反应的时间为10～60min；步骤s2中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜中一种以上；
骤s2中所述催化剂为乙酸、甲酸、盐酸、硫酸中一种以上。
式vi化合物为二(2-氨基)芳基二硫类化合物；所述式vi化合物和式vii化合物的摩尔比为1:2～1:4。
所述式i化合物为二(2-(2-羟基苄叉)氨基)芳基二硫类化合物，其制备的反应方程式为：
所述具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针(式iii，2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物)的另一种制备方法，包括以下步骤：在有机溶剂和保护性气体中，将式v化合物和式vii化合物进行避光反应，获得光激活聚集诱导发光探针。式v化合物和式vii化合物同前面(式i化合物的制备中)所述的式v化合物和式vii化合物。所述避光反应的温度为20～60℃，优选为20～30℃；所述保护性气体为氮气；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺中一种以上；
所述式v化合物与式vii化合物的摩尔比为1:1～1:4。
上述2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物(式iii)制备的反应方程式为：
一种聚集诱导发光化合物为2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物(式iv)，其制备方法包括以下步骤：将具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针(式iii)进行光氧化，获得聚集诱导发光化合物。
所述光为紫外光，所述光氧化是指在有氧的条件下进行紫外光照，光激活聚集诱导发光探针发生氧化生成聚集诱导发光化合物。
研究发现，二(2-(2-羟基苄叉)氨基)芳基二硫类化合物(式i)在硫醇(式ii)作用下，原位生成2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物(式iii)，进一步发生光氧化脱氢反应生成2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物(式iv)。式iv的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物表现出聚集诱导发光性质。
该过程的反应方式为：
采用式i化合物和式ii化合物(硫醇)原位生成式iii化合物(2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物)，其反应方程式为：
所述具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针在生物成像中的应用，特别是在细胞器特异性荧光成像中的应用，通过光激活实现荧光成像。
上述的二(2-(2-羟基苄叉)氨基)芳基二硫类化合物(式i)，在通过与硫醇发生还原反应(式ii)，原位生成2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物(式iii)，在紫外光照射下，式iii化合物发生光氧化脱氢反应，生成具有聚集诱导发光性质的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物(式iv)，通过与商用细胞器染料进行共染实验，证实了其具有优异的细胞器特异性染色效果，还可以在多细胞环境下选择性针对单个细胞或细胞群实现光激活荧光成像。
值得注意的是，本发明的具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针在紫外光光照下，发生光氧化反应，生成的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物表现出聚集诱导发光的性质，这意味着即使在高浓度条件下，2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物也可以进行光激活荧光成像，而传统的荧光染料在高浓度条件下则具有聚集诱导猝灭的现象，因此有效克服了传统的荧光染料的缺陷。此外，原位生成的光激活探针—2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物，本身并不具有荧光成像或者聚集诱导发光的性质，其之所以表现聚集诱导发光的性质是因为在光照条件下将转化为2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物，而2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物具有聚集诱导发光的性质。
在本发明中，“聚集诱导发光”是指荧光化合物在稀溶液中几乎不发光，但在聚集态或固态发出强荧光的现象。例如，在本发明中，由于分子内运动受限和扭曲的分子内电荷转移机制，2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物在溶液态不发出荧光或发光很弱，但在聚集态发出强荧光。在本发明中，“光激活荧光探针”是指一类光响应的分子，在光照下发生化学反应，生成具有荧光发射能力的分子，在生物成像中具有易于调控和高时空分辨率等优势。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针，具有原位生成效率高、光激活效率高、信噪比高、细胞毒性小、斯托克位移大、进入细胞能力强、易于保存和使用等优点；
(2)本发明的具有原位生成能力的光激活聚集诱导发光探针通过原位反应生成，不需要分离，直接用于活细胞内细胞器靶向的特异性光激活荧光成像；
(3)本发明的聚集诱导发光化合物具有聚集诱导发光优势，能有效克服传统荧光染料的聚集诱导猝灭的缺陷。
附图说明
图1为化合物iv-1的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-1在四氢呋喃和水的混合溶液中509nm处的荧光强度比值变化图；
图2为化合物iv-2的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-2在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-2在四氢呋喃和水的混合溶液中570nm处的荧光强度比值变化图；
图3为化合物iv-3的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-3在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和甲苯的混合溶液中不断增加甲苯含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-3在四氢呋喃和甲苯的混合溶液中532nm处的荧光强度的比值变化图；
图4为化合物i-1，化合物iii-1(方法1-化合物iii-1)以及化合物i-1与巯基乙酸乙酯原位反应产物的核磁氢谱叠加图；
图5为化合物i-2，化合物iii-2(方法1-化合物iii-2)以及化合物i-2与巯基乙酸乙酯原位反应产物的核磁氢谱叠加图；
图6为化合物i-3，化合物iii-3(方法1-化合物iii-3)以及化合物i-3与巯基乙酸乙酯原位反应产物的核磁氢谱叠加图；
图7为化合物i-1与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-1，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-1的核磁氢谱叠加图；
图8为化合物i-2与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-2，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-2的核磁氢谱叠加图；
图9为化合物i-3与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-3，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-3的核磁氢谱叠加图；
图10为原位生成的化合物iii-1在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在520nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在340nm处吸收强度比值图；
图11为原位生成的化合物iii-2在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在580nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在358nm处吸收强度比值图；
图12为原位生成的化合物iii-3在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在533nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在341nm处吸收强度比值图；
图13为化合物iii-1(即实施例2中方法1-化合物iii-1)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片；
图14为化合物iii-2(即实施例2中方法1-化合物iii-2)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片；
图15为化合物iii-3(即实施例2中方法1-化合物iii-3)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片；
图16中(a)为hela细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-1在hela细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-1在hela细胞中荧光染色图；(j)为脂滴染料nilered在hela细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-1在光激活后与nilered的荧光信号变化相关图；
图17中(a)为mcf-7细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-1在mcf-7细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-1在mcf-7细胞中荧光染色图；(j)为脂滴染料nilered在mcf-7细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-1在光激活后与nilered的荧光信号变化相关图；
图18中(a)为hela细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-2在hela细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-2在hela细胞中荧光染色图；(j)为脂滴染料bodipy493/503green在hela细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-2在光激活后与bodipy493/503green的荧光信号变化相关图；
图19中(a)为mcf-7细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-2在mcf-7细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-2在mcf-7细胞中荧光染色图；(j)为脂滴染料bodipy493/503green在mcf-7细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-2在光激活后与bodipy493/503green的荧光信号变化相关图；
图20中(a)为hela细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-3在hela细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-3在hela细胞中荧光染色图；(j)为溶酶体染料lysotrackerred在hela细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-3在光激活后与lysotrackerred的荧光信号变化相关图；
图21(a)为mcf-7细胞明场图；(b-g)为原位生成的化合物iii-3在mcf-7细胞中，405nm激光照射下，随扫描时间增加的共聚焦荧光照片变化图；(h)统计的荧光强度变化图；(i)为光激活后的iii-3在mcf-7细胞中荧光染色图；(j)为溶酶体染料lysotrackerred在mcf-7细胞中的荧光染色图；(k)为(i)和(j)的叠加图；(l)为选定区域中，iii-3在光激活后与lysotrackerred的荧光信号变化相关图；
图22为在多个hela细胞的视野下，在780nm双光子激光照射下，(a-d)逐步依次光激活选定的细胞中化合物iii-2的荧光，实现光控的脂滴高时空分辨荧光成像；(e-h)逐步依次光激活选定的细胞中化合物iii-3的荧光，实现光控的溶酶体高时空分辨荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：化合物i-1～化合物i-3的合成
化合物i-1：(2,2'-((1e,1'e)-((二硫基二(2,1-苯撑))二(亚胺基))二(亚甲基))二苯酚)
首先将2,2'-二硫二苯胺(248mg,1mmol)溶解于乙醇(10ml)中，随后向溶液中加入2-羟基苯甲醛(305mg,2.5mmol)，进一步加入1滴醋酸作为催化剂，回流反应1h；待反应结束后，恢复至室温，将反应液过滤，滤渣通过乙醇洗涤，真空干燥得到黄色固体产物(433mg，产率95％)。有关结构表征数据如下：1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ12.57(s,2h),9.03(s,2h),7.73(q,j＝1.5hz,2h),7.59(dd,j1＝1.0hz,j2＝1.5hz,2h),7.52-7.49(m,4h),7.39-7.29(m,4h),7.04-7.00(m,4h)；13cnmr(d6-dmso,125mhz):163.6,160.1,146.0,133.9,132.7,130.3,128.1,127.9,126.1,119.4,118.5,116.7.hrms(maldi-tof):m/z[m+h]+calcd.forc26h21n2o2s2+,457.1039,found,457.1035.
化合物i-2：(2,2'-((1e,1'e)-((二硫基二(2,1-苯撑))二(亚胺基))二(亚甲基))二(4-甲氧基苯酚))
将2,2'-二硫二苯胺(248mg,1mmol)溶解于乙醇(5ml)中，将其逐滴加入5-甲氧基-2-羟基苯甲醛(380mg,2.5mmol)的乙醇(10ml)溶液中；滴加完毕后，向反应液中加入一滴醋酸，随后在氮气保护下，回流反应1h；待反应结束，恢复至室温后，过滤，用乙醇洗涤(10ml×3)滤渣，得到黄色固体产物(495mg,产率96％)。有关结构表征数据如下：1hnmr(d6-dmso,500mhz):11.98(s,2h),9.00(s,2h),7.58(dd,j1＝1hz,j2＝1.5hz,2h),7.48(q,j＝1hz,2h),7.37(td,j1＝7.5hz,j2＝1.5hz,2h),7.32-7.30(m,4h),7.10(q,3hz,2h),3.77(s,6h)；13cnmr(d6-dmso,125mhz):163.0,154.3151.2,146.1,130.4,128.1,127.9,126.0,121.2,119.3,118.3,117.0,115.1,55.6.hrms(maldi-tof):m/z[m+h]+calcd.forc28h25n2o4s2+,517.1250,found,517.1301.
化合物i-3：(2,2'-((1e,1'e)-((二硫基二(2,1-苯撑))二(亚胺基))二(亚甲基))二(4-吗啉甲基)苯酚))
将2,2'-二硫二苯胺(62mg,0.3mmol)溶解于乙醇(5ml)中,将其逐滴加入5-吗啉甲基-2-羟基苯甲醛(130mg，0.6mmol)的乙醇(5ml)溶液中；滴加完毕后，向反应液中加入一滴醋酸作为催化剂，随后在氮气保护下，回流反应1h；待反应结束后，恢复至室温，过滤，用乙醇洗涤(10ml×3)，得到浅黄色固体产物(152mg,产率78％)。有关结构表征数据如下：1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ12.51(s,2h),9.03(s,2h),7.65(d,j＝1.5hz,2h),7.58(j1＝7.5hz,j2＝1.5hz,2h),7.51(dd,j1＝7.5hz,j2＝1.0hz,2h),7.41-7.35(m,4h),7.31-7.28(m,4h),6.97(d,j＝8.5hz,2h),3.58(t,j＝4.5hz,8h),3.44(s,4h),2.37(s,8h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):163.6,159.2,146.1,134.7,132.9,130.3,128.6,128.2,127.9,126.1,119.0,118.5,116.6,66.2,61.6,53.1.hrms(esi):m/z[m+h]+calcd.forc36h39n4o4s2+,655.2407,found,655.2415.
实施例2：化合物iii-1～iii-3的合成
(1)化合物iii-1的合成：2-(2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)苯酚
方法1：将2-氨基苯硫酚(625mg，5mmol)与2-羟基苯甲醛(610mg，5mmol)溶解于甲醇中(5ml)，随后在氮气保护下，室温避光反应20min；待反应结束，将反应液过滤，滤渣通过甲醇洗涤，真空干燥，得到白色固体产物(960mg，产率84％)(方法1-化合物iii-1)。1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ9.81(s,1h),7.38(d,j＝8.0hz,1h),7.10(td,j1＝7.5hz,j2＝1.0hz,1h),6.94(d,j＝7.5hz,1h)6.88-6.76(m,4h),6.66(d,j＝8.0hz,1h),6.56(t,j＝7.5hz,1h),6.47(s,1h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):153.5,147.8,129.6,128.6,125.9,125.2,125.1,121.2,118.8,118.5,114.9,108.6,63.0.
方法2：将化合物i-1(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，室温反应，10min内全部转化，即原位生成化合物iii-1(原位-化合物iii-1)。
(2)化合物iii-2的合成：2-(2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲氧基苯酚
方法1：将2-氨基苯硫酚(625mg，5mmol)与2-羟基-5-甲氧基苯甲醛(760mg，5mmol)溶解于甲醇中(10ml)，随后在氮气保护下，室温避光反应20min，待反应结束，将反应液过滤，滤渣通过甲醇洗涤，真空干燥，得到白色固体产物(776mg，产率60％)(方法1-化合物iii-2)。1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ9.35(s,1h),6.95-6.93(m,2h),6.86(td,j1＝9.5hz,j2＝1.5hz,1h),6.78-6.65(m,4h),6.57(td,j1＝9.5hz,j2＝1.5hz,1h),6.43(d,j＝3.0hz,1h),3.62(s,3h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):152.0,147.7,147.3,130.3,125.2,125.1,121.2,118.6,115.5,113.2,111.9,108.7,63.2,55.3.
方法2：将化合物i-2(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，室温反应，10min内全部转化，即原位生成化合物iii-2(原位-化合物iii-2)。
(3)化合物iii-3的合成：2-(2,3-二氢苯并[d]噻唑-2-基)-4-(吗啉甲基)苯酚
方法1：将2-氨基苯硫酚(125mg，1mmol)与2-羟基-5-(吗啉甲基)苯甲醛(221mg，5mmol)溶解于甲醇中(5ml)，随后在氮气保护下，室温反应20min，待反应结束，将反应液旋干，然后加2ml甲醇重结晶，过滤并将滤渣真空干燥得到白色固体产物(171mg，产率52％)(方法1-化合物iii-3)。1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ9.75(s,1h),7.37(d,j＝2.0hz,1h),7.02(dd,j1＝8.5hz,j2＝2.0hz,1h),6.93(d,j＝7.5hz,1h),6.86(td,j1＝7.5hz,j2＝1.0hz,1h),6.76(d,j＝8.0hz,2h),6.65(d,j＝7.5hz,1h),6.56(td,j1＝7.5hz,j2＝1.0hz,1h),6.50(d,j＝2.5hz,1h),3.51(t,j＝4.5hz,4h),3.30(d,j＝5.0hz,2h),2.27(s,4h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):152.7,147.8,129.3,128.9,127.7,126.7,125.3,125.1,121.1,118.4,114.6,108.6,66.1,63.3,62.2,53.0.
方法2：将化合物i-3(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，室温反应，10min内全部转化，即原位生成化合物iii-3(原位-化合物iii-3)。
实施例3：化合物iv-1～iv-3的合成
化合物iv-1的合成：2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚
方法1：将原位生成的化合物iii-1(即原位-化合物iii-1)在紫外光照下进行光氧化反应，光照时间为10h，获得化合物iv-1(原位-化合物iv-1)；
方法2：将2-氨基苯硫酚(250mg，2mmol)与2-羟基苯甲醛(244mg，2mmol)溶解于甲醇中(5ml)，向溶液滴加浓盐酸(37％，169μl)和过氧化氢(30％aq，188μl)，随后在空气下，室温反应2h；待反应结束，将反应液过滤，滤渣通过甲醇洗涤，真空干燥，得到白色固体产物(435mg，产率96％)(即方法2-化合物iv-1)。有关结构表征数据如下：1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ11.59(s,1h),8.19-8.06(m,3h),7.57-7.40(m,3h),7.10-7.01(m,2h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):165.2,156.2,151.4,134.2,132.5,128.5,126.5,125.1,122.1,122.0,119.8,118.3,116.9.hrms(esi):m/z[m+h]+calcd.forc13h10nos+,228.0478,found,228.0475.
化合物iv-2的合成：2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲氧基苯酚
方法1：将原位生成的化合物iii-2(即原位-化合物iii-2)在紫外光照下进行光氧化反应，光照时间为10h，获得化合物iv-2(原位-化合物iv-2)；
方法2：将2-氨基苯硫酚(250mg,2mmol)与2-羟基-5-甲氧基苯甲醛(304mg,2mmol)溶解于甲醇中(5ml)，向溶液滴加浓盐酸(37％,169μl)和过氧化氢(30％aq,188μl)，随后在空气下，室温反应2h；待反应结束，将反应液过滤，滤渣通过甲醇洗涤，真空干燥得到浅黄色固体产物(493mg，产率96％)(即方法2-化合物iv-2)。有关结构表征数据如下：1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ11.03(s,1h),8.14(d,j＝8.0hz,1h),8.07(d,j＝8.0hz,1h),7.72(d,j＝3.0hz,1h),7.54(td,j1＝8.0hz,j2＝1.0hz,1h),7.44(td,j1＝8.0hz,j2＝1.0hz,1h),7.06-7.01(m,2h),3.81(s,3h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):163.7,151.7,150.8,149.8,134.2,125.8,124.4,121.6,121.4,119.1,118.1,117.4,110.5,55.0.hrms(esi):m/z[m+h]+calcd.forc14h12no2s,258.0583,found,258.0581.
化合物iv-3的合成：2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-(吗啉甲基)苯酚
方法1：将原位生成的化合物iii-3(即原位-化合物iii-3)在紫外光照下进行光氧化反应，光照时间为10h，获得化合物iv-3(原位-化合物iv-3)；
方法2：2-氨基苯硫酚(63mg,0.5mmol)与2-羟基-5-吗啉甲基苯甲醛(111mg,2mmol)溶解于甲醇中(5ml)，向溶液滴加浓盐酸(37％,42μl)和过氧化氢(30％aq,47μl)，随后在空气下，室温反应2h，待反应结束，将反应液旋干，加入四氢呋喃洗涤，固体部分真空干燥，得到灰色固体产物(124mg，产率76％)(即方法2-化合物iv-3)。有关结构表征数据如下：1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ12.04(brs,1h),8.12(d,j＝8.0hz,2h),8.04(d,j＝8.0hz,1h),7.52(t,j＝7.5hz,1h),7.42(t,j＝7.5hz,1h),7.30(d,j＝8.0hz,1h),7.03(d,j＝8.5hz,1h),3.58(s,4h),3.45(s,2h),2.38(s,4h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):165.1,151.6,135.1,133.1,128.5,125.8,124.2,123.9,121.7,121.4,118.5,117.8,66.2,62.3,53.1.hrms(esi):m/z[m+h]+calcd.forc18h19n2o2s,327.1162,found,327.1157.
实施例4:
化合物iv-1的光物理性质表征：
将四氢呋喃和水按照不同的体积比(四氢呋喃:水＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，8:92，6:94，4:96，2:98，1:99)混合，形成含水量不同的混合液，将化合物iv-1(即方法2-化合物iv-1)溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10-5mol·l-1，随后检测荧光发射光谱，结果见图1。图1为化合物iv-1(方法2制备的化合物iv-1)的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-1在四氢呋喃和水的混合溶液中509nm处的荧光强度比值变化图。当不断增加混合溶液体系中的水含量时，其酮式发光(509nm)的强度首先逐渐增加(四氢呋喃:水从100:0到40:60)，随后降低(四氢呋喃:水从40:60到10:90)，继续增加水含量时(四氢呋喃:水从10:90到4:96)，酮式发光迅速增强，这是由于溶解度降低导致聚集体生成，分子内形成氢键且分子内运动受限，表现出聚集诱导发光性质。当水含量进一步增加时(四氢呋喃:水从4:96到1:99)，其荧光强度略有下降，这可能是由于其溶解度迅速降低，导致无序聚集体造成的。
原位生成的式iv-1化合物(原位-化合物iv-1)与方法2-化合物iv-1的光物理性质相同。
实施例5:
化合物iv-2的光物理性质表征：
将四氢呋喃和水按照不同的体积比(四氢呋喃:水＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，8:92，6:94，4:96，2:98，1:99)混合，形成含水量不同的混合液，将化合物iv-2(即方法2-化合物iv-2)溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10-5mol·l-1，随后检测荧光发射光谱，结果见图2。图2为化合物iv-2(即方法2-化合物iv-2)的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-2在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-2在四氢呋喃和水的混合溶液中570nm处的荧光强度比值变化图。
当不断增加混合溶液体系中的水含量时，其酮式发光(570nm)的强度首先逐渐增加(四氢呋喃:水从100:0到30:70)，随后降低(四氢呋喃:水从30:70到10:90)，继续增加水含量时(四氢呋喃:水从10:90到4:96)，酮式发光迅速增强，这是由于溶解度降低导致聚集体生成，分子内形成氢键且分子内运动受限，表现出聚集诱导发光性质。当水含量进一步增加时(四氢呋喃:水从4:96到1:99)，其荧光强度略有下降，这可能是由于其溶解度迅速降低，导致无序聚集体造成的。原位生成的式iv-2化合物(原位-化合物iv-2)与方法2-化合物iv-2的光物理性质相同。
实施例6:
化合物iv-3的光物理性质表征：
将四氢呋喃和甲苯按照不同的体积比(四氢呋喃:甲苯＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，5:95，1:99)混合，形成甲苯含量不同的混合液，将化合物iv-3(即方法2-化合物iv-3)溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10-5mol·l-1，随后检测荧光发射光谱，结果见图3。图3为化合物iv-3(即方法2-化合物iv-3)的紫外吸收和荧光发射光谱图；(a)化合物iv-3在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(左侧)和在四氢呋喃和甲苯的混合溶液中不断增加甲苯含量的荧光发射光谱图(10-5mol·l-1，右侧)；(b)化合物iv-3在四氢呋喃和甲苯的混合溶液中532nm处的荧光强度的比值变化图。
当不断增加混合溶液体系中的甲苯含量时，酮式发光(532nm)强度逐渐增加，这是由于甲苯含量增加时，由于溶解度降低导致聚集体生成，分子内形成氢键且分子内运动受限，表现出聚集诱导发光性质。原位生成的式iv-3化合物(原位-化合物iv-3)与方法2-化合物iv-3的光物理性质相同。
实施例7
通过测量化合物iv-1(方法2-化合物iv-1)，iv-2方法(2-化合物iv-2)和iv-3(方法2-化合物iv-3)在四氢呋喃溶液中和固态(薄膜态)的量子产率和荧光寿命(表1)，发现相对于在四氢呋喃溶液中，化合物iv-1在薄膜态的量子产率增加了94.4倍，荧光寿命增加了6.0倍；化合物iv-2在薄膜态的量子产率增加了33.4倍，荧光寿命增加了5.2倍；化合物iv-3在薄膜态的量子产率增加了25.8倍，荧光寿命增加了4.1倍；证实了化合物iv的聚集诱导发光性质。而且化合物iv在薄膜态的斯托克位移均大于170nm，远优于传统的荧光材料(斯托克位移通常小于40nm)，非常有利于其在生物成像中的应用。原位-化合物iv-1～iv-3也具有表1的光物理性质。
表1化合物iv-1，iv-2与iv-3在四氢呋喃溶液态和固态的光物理性质表征
实施例8:
通过核磁氢谱检测实施例1中化合物i-1～i-3，实施例2中方法1-化合物iii-1～方法1-化合物iii-3以及原位生成化合物iii-1～iii-3(原位-化合物iii-1～原位-化合物iii-3)，测试结果见图4～图6。原位生成的化合物iii-1～iii-3在光照下，通过光氧化反应，转化为化合物iv-1～iv-3(原位-化合物iv-1～iv-3)，该转化过程通过核磁氢谱检测得到了证实(见图7～图9)。
图4为化合物i-1，化合物iii-1(方法1-化合物iii-1)以及化合物i-1与巯基乙酸乙酯原位反应产物(原位生成化合物iii-1)的核磁氢谱叠加图；图5为化合物i-2，化合物iii-2(方法1-化合物iii-2)以及化合物i-2与巯基乙酸乙酯原位反应产物(原位生成化合物iii-2)的核磁氢谱叠加图；图6为化合物i-3，化合物iii-3(方法1-化合物iii-3)以及化合物i-3与巯基乙酸乙酯原位反应产物(原位生成化合物iii-3)的核磁氢谱叠加图。
图7为化合物i-1与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-1(原位生成化合物iii-1)，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-1的核磁氢谱叠加图；图8为化合物i-2与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-2，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-2的核磁氢谱叠加图；图9为化合物i-3与巯基乙酸乙酯原位反应生成化合物iii-3，随后在365nm紫外光照下，生成化合物iv-3的核磁氢谱叠加图。
实施例9:
原位生成的化合物iii-1～iii-3(原位-化合物iii-1～原位-化合物iii-3)在光照下可转化为具有聚集诱导发光性质的化合物iv-1～iv-3，该转化过程通过紫外-可见吸收和荧光检测得到了证实。
原位生成的化合物iii-1在水：二甲基亚砜(99:1，v/v)的溶液中，365nmuv灯照射下，随光照时间延长，在520nm处的荧光强度逐渐增加，同时在340nm处的吸收强度逐渐增加，这是由于化合物iii-1通过光氧化脱氢反应，生成化合物iv-1造成的(见图10)。化合物iii-2～iii-3在uv灯照射下，其荧光和紫外-可见光吸收光谱也有类似的变化(见图11～图12)。
图10为原位生成的化合物iii-1在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在520nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在340nm处吸收强度比值图。图11为原位生成的化合物iii-2在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在580nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在358nm处吸收强度比值图。图12为原位生成的化合物iii-3在二甲基亚砜和水的混合溶液中(二甲基亚砜:水的体积比＝1:99，10-4mol·l-1)，365nm光照下，随时间变化的(a)荧光发射光谱图；(b)在533nm处荧光强度比值图；(c)紫外-可见吸收光谱图；(d)在341nm处吸收强度比值图。
实施例10:
化合物iii-1～iii-3(即实施例2中方法1-化合物iii-1～方法1-化合物iii-3)在固态，365nmuv灯照射下，随光照时间延长，其荧光强度不断增加(见图13～图15)，这是由于化合物iii在固态也可以通过光氧化脱氢反应，生成化合物iv造成的。图13为化合物iii-1(即实施例2中方法1-化合物iii-1)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片。图14为化合物iii-2(即实施例2中方法1-化合物iii-2)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片。图15为化合物iii-3(即实施例2中方法1-化合物iii-3)在365nm紫外光照下，随时间变化的固态荧光照片。
实施例11:
原位生成的化合物iii-1～iii-3在光激活荧光成像中的应用：
将化合物i-1(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，原位生成化合物iii-1，随后取混合液5.0μl加入到含细胞的hbss缓冲液中(1.0ml)，其在hela细胞或mcf-7细胞(细胞购自美国atcc公司)内刚开始并不发出荧光，在405nm激光照射下，其荧光强度迅速增加，当光照时间增加至10min时，其在hela细胞以及mcf-7细胞内的荧光强度，分别增强至初始值的约5.5倍和9.0倍，表明原位生成的化合物iii-1具有很高的光激活效率。通过与商品化的脂滴染料nilered的共染实验表明，化合物iii-1可用于脂滴特异性光激活荧光成像(见图16～图17)。
将化合物i-2(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，原位生成化合物iii-1，随后取混合液5.0μl加入到含细胞的hbss缓冲液中(1.0ml)，原位生成的化合物iii-2在hela细胞或mcf-7细胞内刚开始并不发出荧光，在405nm的激光照射下，其荧光发射强度迅速增加，随着激光扫描时间增加至10min，其在hela细胞以及mcf-7细胞内的荧光强度，分别增强至初始值的约53倍和18倍，表明原位生成的化合物iii-2具有很高的光激活效率。通过与商品化的脂滴染料bodipy493/503的共染实验表明，化合物iii-2可用于脂滴特异性光激活荧光成像(见图18～图19)。
将化合物i-3(10.0mm,100μl)与巯基乙酸乙酯(20.0mm,100μl)的二甲基亚砜溶液混合，原位生成化合物iii-3，随后取混合液2.0μl加入到含细胞的hbss缓冲液中(1.0ml)，原位生成的化合物iii-3在hela细胞或mcf-7细胞内刚开始并不发出荧光，在405nm激光照射下，其荧光强度迅速增加，随着激光扫描时间增加至50s，其在hela细胞以及mcf-7细胞内的荧光强度，分别增加至初始值的约6.2倍和4.5倍，表明原位生成的化合物iii-3具有很高的光激活效率。通过与商品化的溶酶体染料lysotrackerred的共染实验表明，化合物iii-3可用于溶酶体的特异性光激活荧光成像(见图20～图21)。
实施例12
原位生成的化合物iii可以用于光控高时空分辨成像：以hela细胞为例，在多细胞环境下，通过光照控制，化合物iii-2可以对不同细胞内脂滴依次激活，化合物iii-3可以对不同细胞内溶酶体依次激活(见图22)。原位生成的化合物iii的光控高时空分辨成像能力，特别有利于细胞器的运动变化监测以及复杂生理环境下细胞器的生理功能研究。
本发明建立了原位高效生成2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类的方法，可通过光照激活，生成具有聚集诱导发光性质的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物。由于分子内运动受限和激发态分子内质子转移机制，2-(2-羟基苯基)苯并噻唑类化合物在溶液态不发出荧光或发光很弱，但在聚集态发出强荧光。原位生成的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑啉类化合物，可作为光激活荧光探针，用于细胞器靶向的光控高时空分辨率荧光成像。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。