本发明涉及中药提取领域，涉及甾体类化合物及提取方法及其用途。
背景技术：
近年来研究发现，肿瘤细胞中普遍存在糖酵解第一步关键代谢酶hexokinse2(hk2)的过表达情况，它在体内主要起着磷酸化葡萄糖的作用。研究表明，
hk2在肿瘤发生、发展过程中起着重要作用；在hk2基因敲除的肺癌细胞中存在着低水平的葡糖糖派生的核苷酸和谷氨酰胺来源的碳利用率。上述研究提示，hk2是atp合成、核苷酸合成、脂肪酸合成、丝氨酸生物合成途径以及碳原子从糖酵解进入三羧酸循环(tca)等过程所必需的(patrakc,wangq,bhaskarpt,etal.hexokinase2isrequiredfortumorinitiationandmaintenanceanditssystemicdeletionistherapeuticinmousemodelsofcancer.cancercell,2013,24(2):213-228.)。因此，抑制hk2活性，降低癌细胞内atp产量以及核苷酸、脂肪酸等物质的合成，进而抑制肿瘤细胞的增殖成为治疗癌症的新的治疗策略。hk2是潜在的抗肿瘤靶点，寻找高效低毒的hk2抑制剂用于肿瘤的治疗，有极为迫切的市场需求。
人体内代谢酶idh1突变与癌症的发生、发展关系密切，异柠檬酸脱氢酶(idh1/r132)的精氨酸残基之一的体细胞点突变使低级胶质瘤、继发性胶质瘤、胶质母细胞瘤、软骨肉瘤和急性髓性白血病(aml)的不同亚型得到明确。在idh1中与癌症相关的点突变赋予一个新突变活性，从而使得α-酮戊二酸(α-kg)转化为r-2-羟戊二酸(2hg)。idh1突变会破坏酶的亲和力，导致酶与底物结合能力降低，并且突变的idh1还能与野生型idh1竞争底物，突变的idh1与底物结合形成二聚体，进一步阻断idh1的活性。idh1突变后，出现一种新能力，把α-kg还原成2-hg，2-hg大量累积，已证明高浓度的2hg能够抑制α-kg依赖性双加氧酶，包括组蛋白和dna去甲基化以及块细胞分化，从而使正常细胞向恶性转化。目前国内尚未有此靶点的抑制剂研究，国外研究的化学合成抑制剂agi-5198、agi-6780有望成为新型抗癌药物(rohled,popovici-mullerj,palaskasn,etal.aninhibitorofmutantidh1delaysgrowthandpromotesdifferentiationofgliomacells.science,2013,340(6132):626-630.)。然而，天然来源的idh1抑制剂未见文献报道。
灵芝为多孔菌科真菌紫芝(ganodermasinensezhao.xuetzhang)或赤芝[ganodermalucidum(leyss.exfr.)karst.]的干燥子实体，产于欧洲、美洲、非洲、亚洲东部，在我国普遍分布，但以长江以南为多，分布于长江以南高温多雨地带，具体省份为：湖南、安徽、江西、福建、广东、广西。灵芝为中国传统中药，在我国已有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。具有补气安神，止咳平喘的作用，常用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等。国内外学者通过体内、体外实验证实了灵芝具有镇静、镇痛及安定(张虎,杜欣娜,朱金玲,罗佳滨.灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑海马区ncam-l1表达的影响.黑龙江医药科学,2011,34,35.)、强心(张旺信,冯永堂,张秋玲.泰山赤灵芝对沙土鼠脑缺血再灌注后脑及血清sod、mda的影响.泰山医学院学报,2010,31,12-15.)、免疫调节(章灵华.灵芝孢子粉提取物在体内外的免疫效应.中国免疫学杂志.1994,10,169-172.)、抗肿瘤(吕明明,王婷婷,钱倩.灵芝孢子油对肺腺癌癌性胸水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用.现代肿瘤医学，2011,19,1289-1292.)、抗氧化(jia,j.,zhang,x.,hu,y.s.evaluationofinvivoantioxidantactivitiesofcanodermalucidumpolysaccharidesinstz-diabeticrats.foodchemistry.2009,115,32-36.)、抗衰老(林晓,潘文嘉.灵芝多糖抗皮肤衰老作用研究.辽宁中医药大学学报，2009,11,174-175.)、护肝(陈晓莉,王胜春,田卫斌.灵芝及其与丹参、五味子、柴胡配伍对小鼠实验性肝损伤的影响.第三军医大学学报,2001,23,567-570.)、降血糖等作用(张慧娜,林志彬.灵芝多糖对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响.中国临床药理学与治疗学,2003,8,265-268.)。灵芝的化学成分丰富，目前从灵芝属中分离得到的化学成分主要有以下几类:三萜类、多糖类、甾体类、芳香类、生物碱类、其它类等。但从紫芝中提取的甾体类化合物及其作为hk2抑制剂或idh抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供甾体类化合物。
本发明的第二个目的是提供所述甾体类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供所述甾体类化合物的用途。
本发明的第四个目的是提供含有所述甾体类化合物的药物组合物。
本发明的第五个目的是提供上述药物组合物的用途。
本发明的技术方案如下：
甾体类化合物，具有式(i)或(ii)的结构：
其中，
r1为h,oh或c1-c4烷氧基；
r2为h或oh；
r3为h,oh或＝o；
(ii)中：
9,11位为单键或双键。
进一步地，
式(i)中，
r1、r2、r3同时为oh；
式(ii)中，
r1为h,oh或och3；
r2为h或oh；
r3为h,oh或＝o；
本发明优选如下化合物：
本发明所述的甾体类化合物通过如下方法提取，具体步骤包括：
(1)以多孔菌科灵芝属真菌紫芝的干燥子实体为原料，加入原料8-12质量倍的体积分数为70％-90％乙醇水溶液，回流提取，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5-10质量倍的水中，依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压回收溶剂，分别得到环己烷层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏以及剩余的水层样品；
(3)环己烷层浸膏和乙酸乙酯层浸膏分别经硅胶柱色谱分离，环己烷层浸膏以体积比为100:0–0:100的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.c1-c8，乙酸乙酯层浸膏以体积比为100:0–0:100的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得馏分fr.e1-e11；
(4)馏分fr.c2经过重结晶(体积比1:1-5:1的环己烷-乙酸乙酯)，得到馏分fr.c20；
(5)馏分fr.c20制备薄层色谱分离，以体积比2:1-5:1环己烷-乙酸乙酯进行展板，所得条带用甲醇洗脱得化合物4；
(6)馏分fr.e7、fr.e8、fr.e9、fr.e10分别经ods柱色谱分离，以体积比为10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.e71-e75；fr.e81-e85；fr.e91-e95及fr.e10-1-e10-5；
(7)馏分fr.e75、fr.e95分别经制备薄层纯化，以体积比2:1-1:1的石油醚-丙酮和体积比4:1-5:1的二氯甲烷-甲醇进行展板，所得条带用甲醇洗脱得到馏分fr.e751和fr.e951；
(8)馏分fr.e751、fr.e951分别经制备hplc色谱，以体积比为80％-95％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1、5、7、6和8；
(9)馏分fr.e85、fr.e10-5分别经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相等度洗脱，得到馏分fr.e851和fr.e10-5-1；
(10)馏分fr.e851、fr.e10-5-1分别经制备hplc色谱，以体积比为80％-95％和55％-65％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3和2；
步骤(1)中回流提取2-4次，每次提取2-4小时；
本发明还提供了所述的甾体类化合物在制备hk2抑制剂中的应用。
本发明还提供了所述的甾体类化合物在制备idh抑制剂中的应用。
进一步地，本发明提供了所述的甾体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步提供了一种药物组合物，该组合物包含甾体类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明还提供了所述药物组合物在制备hk2抑制剂或idh抑制剂药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的甾体类化合物对糖酵解第一步关键酶己糖激酶(hk2)或α-kg依赖性双加氧酶具有明显抑制作用，提示本发明化合物可作为肿瘤治疗的潜在候选药物。
附图说明
图1为化合物2与hk2氨基酸残基作用模式图；
图2为化合物2和13对hk2的酶活性抑制作用；
图3为mst试验测定化合物2和13与hk2之间的结合；
图4为化合物2对sw1990和vero细胞的量效曲线；
图5为mst试验测定化合物1与idh1之间的结合
图6为化合物1特异性的与idh1r132h结合；
图7为化合物1在体外抑制idh1的活性；
图8为化合物1对ht1080细胞中的h3k9me3的抑制作用；
图9为敲低idh1r132c减弱化合物1对ht1080细胞的生长抑制作用。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
甾体类化合物的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以多孔菌科灵芝属真菌紫芝的干燥子实体(9.5kg)为原料，加入原料10质量倍的体积分数为90％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏(214g)；
(2)将总浸膏分散到5l水中，依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压回收溶剂，分别得到环己烷层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏以及剩余的水层样品；
(3)环己烷层浸膏(37g)和乙酸乙酯层浸膏(80g)分别经硅胶柱色谱分离，分别以体积比为100:0–0:100的石油醚-乙酸乙酯和体积比为100:0–0:100的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.c1、fr.c2、fr.c3、fr.c4、fr.c5、fr.c6、fr.c7、fr.c8及fr.e1、fr.e2、fr.e3、fr.e4、fr.e5、fr.e6、fr.e7、fr.e8、fr.e9、fr.e10及fr.e11；
(4)馏分fr.c2经过重结晶(环己烷-乙酸乙酯3:1)，得到馏分fr.c20；
(5)馏分fr.c20制备薄层色谱分离，以体积比3:1环己烷-乙酸乙酯进行展板，所得条带用甲醇洗脱得化合物4(110.3mg)；
(6)馏分fr.e7、fr.e8、fr.e9、fr.e10分别经ods柱色谱分离，以体积比为10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.e71、fr.e72、fr.e73、fr.e74、fr.e75；fr.e81、fr.e82、fr.e83、fr.e84、fr.e85；fr.e91、fr.e92、fr.e93、fr.e94、fr.e95及fr.e10-1、fr.e10-2、fr.e10-3、fr.e10-4、fr.e10-5；
(7)馏分fr.e75、fr.e95分别经制备薄层纯化，以体积比2:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇进行展板，所得条带用甲醇洗脱得到馏分fr.e751和fr.e951；
(8)馏分fr.e751、fr.e951分别经制备hplc色谱，以体积比为95％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1(71.9mg)、5(85.5mg)、7(9.7mg)、6(5.5mg)和8(33.2mg)；
(9)馏分fr.e85、fr.e10-5分别经sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相等度洗脱，得到馏分fr.e851和fr.e10-5-1；
(10)馏分fr.e851、fr.e10-5-1分别经制备hplc色谱，以体积比为95％和60％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3(10.7mg)和2(16.3mg)；
化合物的物理化学和常数如下：
化合物1：白色粉末(meoh)；ir(kbr)νmax3433,2923,2362,1643,1456,1108cm-1；
化合物2：白色粉末(meoh)；ir(kbr)νmax3449,2923,1639,1459,1076cm-1；
表1化合物1的碳谱和氢谱数据
注：1h-nmr，600mhz，cd3od；13c-nmr，150mhz，cd3od。
表2化合物2的碳谱和氢谱数据
注：1h-nmr，600mhz，cd3od；13c-nmr，150mhz，cd3od。
通过理化常数和现代波谱学手段(hresims和nmr)，结合文献相关数据，鉴定它的结构，化合物1和2均为未见文献报道的新化合物，如下所示：
实施例2
甾体类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以多孔菌科灵芝属真菌紫芝的干燥子实体为原料，加入原料8质量倍的体积分数为70％乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5倍质量水中，依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压回收溶剂，分别得到环己烷层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏以及剩余的水层样品；
(3)-(24)同实施例1(3)-(24)。
实施例3
甾体类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以多孔菌科灵芝属真菌紫芝的干燥子实体为原料，加入原料10质量倍的体积分数为90％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到10倍质量水中，依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取液减压回收溶剂，分别得到环己烷层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏以及剩余的水层样品；
(3)-(24)同实施例1(3)-(24)。
实施例4
通过虚拟筛选确定化合物2与hk2的结合
(1)通过proteindatabank(pdb)数据库获得hk2的蛋白质晶体结构(code：2nzt)，hk2蛋白质三维结构加极性氢，并加载电荷，以配体(葡萄糖)来确定靶标蛋白活性位点，除特殊说明外，其它参数均为默认参数，对受体势能进行计算；
(2)运用icm-pro软件自带chemistry/clusterset模块对筛选出的化合物进一步筛选，最终选择能量最低和最有利的构象的配体，结果如图1所示；
hk2的大量表达与纯化
(1)将编码hk2(genebank:bc021116.1)的基因克隆至pet26b的载体上；(2)将重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)(invitrogen)中，使用sb培养基于37℃，250rpm摇床中培养至对数生长期(od600＝0.8-1.0)，加入0.4mm异丙基异丙基硫黄苷(iptg)置于摇床15℃，220rpm诱导表达20h；
(3)诱导表达结束后，将菌液于4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；
(4)向收集菌体中加入裂解缓冲液，进行超声波细胞破碎，破碎参数：超声功率40w，超声1s，总超声时间设置为3min，超声3轮。破碎菌液于4℃，14000rpm高速离心，取上清；
(5)依次使用镍亲和层析法、阴离子交换色谱和分子筛色谱法提纯该蛋白质对该蛋白进行纯化。
化合物2和13体外hk2酶抑制活性筛选
(1)将10μl重组人hk2蛋白(0.1mg/ml)与5μl待测试化合物于37℃恒温震荡培养箱中共孵育10min，加入剩余85μl反应体系(100mmtrishcl，ph8.0,5mmmgcl2,200mmglucose,0.8mmatp,1mmnad+,0.25unitsofg6p-dh)后，将96孔板放入spectramax酶标仪中。酶标仪参数设置：检测波长为340nm，读数时间为20min，读数间隔为2min。
(2)化合物设置浓度梯度，每个浓度设置三个复孔，使用graphpadprism5计算出相应化合物的酶活性半数抑制浓度(ic50)，结果如图2。
化合物2和13与hk2的kd值测定
(1)10μlhk2蛋白与20μlmonolithnttmproteinlabelingkitred等体积混匀，置于暗处室温孵育30min；
(2)将该标记体系通过分子排阻色谱除去游离的荧光标记染料，收集荧光染料标记的蛋白样品；
(3)将待测试药物按照一定梯度比稀释成12个浓度梯度，取各浓度梯度的药物溶液于等体积的已标记蛋白样品，离心；
(4)使用仪器专用的标准毛细管按照浓度高低顺序依次虹吸样品，置于微量热泳动仪monolithnt.115instrument(germany)中进行测定。参数设置：ledpower30％，laspower20-40％；
(5)通过mo.affinityanalysisv2.2.4*软件进行实验数据分析，软件可自动拟合出待测化合物与hk2的解离常数，结果如图3。
细胞水平活性测试
人胰腺癌细胞sw1990(atcc，美国)和非洲绿猴肾细胞vero(武汉博士德生物工程有限公司)培养于10％热灭活胎牛血清(上海中乔新舟生物科技有限公司)的葡萄糖培养基，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育生长。
cck8法检测细胞存活率
(1)实验分组：对照组(含细胞)、实验组(不同浓度甾体类化合物+细胞)、空白对照组(不含细胞，其他过程同实验组)。每组均设3个复孔。
(2)实验步骤：
1)分别取对数生长期的sw1990细胞和vero细胞，胰蛋白酶消化，以6000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％co2，培养24h。
3)给予不同浓度化合物2(0-100μm)，继续培养48h。
4)弃掉培养基，每孔均加入100μl的含10％cck8的培养基，培养20min后，酶标仪检测450nm处各孔的od值并用graphpadprism5.0计算ic50。结果如图4：
实施例5：
测定化合物1与idh1酶的结合能力
1、idh1与idh1r/h蛋白表达和纯化
(1)idh1(ncbireferencesequence:np_002159.2)与idh1r/h(在idh1基因序列的基础上将132位精氨酸突变为组氨酸)基因转入pet28a(novagen公司，cat.no.69864-3)质粒，将构建好的测序正确的质粒转入表达宿主感受态细胞bl21de3，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的lb培养基中，37℃，200rpm，摇床过夜培养。次日按1:100(体积比)接入含有相应抗性的1llb液体培养基中，继续摇床培养至对数期，使od600＝0.8，加入iptg至终浓度0.4mm，转移至20℃，200rpm继续诱导培养过夜。(2)离心收集细胞，加入适量体积的裂解液，超声破碎细胞，将破碎液体4℃，14000rpm离心30min，分离上清和沉淀，利用aktapure蛋白纯化系统，依次使用镍亲和层析法、阴离子交换色谱和分子筛色谱法提纯该蛋白质对该蛋白进行纯化。
2、mst(微量热泳动仪)测定与idh1r/h酶的结合能力
(1)10μlidh1r/h蛋白与20μlmonolithnttmproteinlabelingkitred等体积混匀，置于暗处室温孵育30min；
(2)将该标记体系通过分子排阻色谱除去游离的荧光标记染料，收集荧光染料标记的蛋白样品；
(3)待测化合物用dmso溶解，配制成30mm母液，随后用缓冲液(20mmhepes)稀释成600μm的初始工作液1，测定缓冲液为含2％dmso的20mmhepes。初始工作液1作为结合力测定的最高浓度，然后用测定缓冲液倍比稀释工作液1，共稀释9次，得到10个工作液，工作液10的浓度为1.17μm。各工作液加入等体积(终浓度为50nm)idh1r/h酶蛋白；
(4)使用仪器专用的标准毛细管按照浓度高低顺序依次虹吸样品，置于微量热泳动仪monolithnt.115instrument(germany)中进行测定。参数设置：ledpower30％，laspower20-40％；
(5)通过mo.affinityanalysisv2.2.4*软件进行实验数据分析，软件可自动拟合出待测化合物1与idh1r/h的解离常数，结果如图5。待测化合物1和idh1r/h酶蛋白结合的平衡解离常数kd值为18.4±3.95μm。
体外活性试验
1、参照文献方法(zheng,b.,etal.,medicinalchemistryletters,2013.4(6):
p542-546.)，对筛选的药物进行酶活性测试。
1.1.idh1酶活性测试
idh1酶反应体系：
总的反应体系200μl，加入idh1酶的量为43nm。
1.2.idh1r132h突变酶活性测试
idh1mutant的反应体系
总的反应体系200μl，加入idh1酶的量为2μm。
酶活性测试检测指标为nadph，其可用酶标仪在340nm处检测吸收。
实验结果(图6)：ic50值为21.69±0.144μm
2.细胞实验
(1)选取idh1r132c高表达的ht1080细胞，收取细胞上清，用甲醇沉淀蛋白质，提取2-hg，用质谱检测化合物1对ht1080细胞内2-hg的抑制水平，并用cck8(cellcountingkit-8)检测化合物1对ht1080细胞存活率的影响。细胞：ht1080cell培养基：mem(含neaa)+10％fbs
实验过程：收取细胞，计数；接种96孔板，5000cell/well，100ul/well，24小时后换液加药；药物浓度为：100,50,25,12.5,6.25,3.125μm，药物稀释液为细胞培养基，所有药物初始浓度均为10mm于dmso中；加药48h后，收取细胞上清，按照1:4比例加入甲醇(上清：甲醇)，混匀，3000rpm离心20min；上清分装后-80℃保存，进行质谱检测。板底细胞加入含10％cck8的培养基37℃孵育30min，用酶标仪测定450nm吸光度。
实验结果(图7)：对ht1080细胞ic50值为42.55±0.68μm
对2-hg的ic50值为35.87±0.22μm
(2)细胞内信号通路实验
ht1080细胞铺6孔板，分为化合物实验组和对照组，药物作用不同时间后，收蛋白样品，用westernblot和免疫荧光检测，观察化合物是否抑制h3k9me3的表达，见图8：
(3)化合物作用于idh1r/h靶点的确证实验rnai敲低idh1r/h表达
用sirna表达载体或表达框架转导至细胞株中，并通过蛋白质免疫印迹(westernblot)检测相关蛋白表达水平的变化。转染24h后，收集转染后细胞进行westernblot检测idh1r/h蛋白表达水平，得到成功敲低idh1r/h的细胞后以不含rnai序列的空病毒作为对照，以验证化合物对idh1r/h的靶向作用，见图9。
含有本发明所述化合物或组合物或以作为hk2抑制剂或药物可以为适用于口服或注射等应用形式，例如，可为片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。