陈醋生产中提高发酵液酒精度、增加酯香成分的方法与流程

本发明涉及陈醋生产的酒精发酵技术领域，尤其涉及一种陈醋生产的酒精发酵阶段来提高发酵液酒精度、增加酯香成分的方法。

背景技术：

传统山西老陈醋的生产是采用大曲制醋，大曲中含有的多种微生物参与各个生化过程，多种代谢活动产生了丰富的醇、酸和氨基酸等物质，使食醋香味浓郁，口感柔和，而大曲中丰富的酶系也给陈醋增添了独一无二的口感。

大曲采用自然接种的传统工艺，生产周期大约有一个月左右，所用时间长，在传统山西老陈醋的生产中大曲的使用量通常为原料的60％左右，导致陈醋的生产成本比较高(目前每块大曲约十二元左右)。经过对大曲中的糖化酶进行研究得到，大曲中的α-淀粉酶活力和淀粉脱支酶活力明显不高，这会导致对原料淀粉的糖化不充分、糖化速度慢、可发酵性糖的转化率低、最终造成生产出醋率低、发酵后酒精度低、生产效益差及风味质量不高的结果。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供一种陈醋生产中提高发酵液酒精度、增加酯香成分的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种陈醋生产中提高发酵液酒精度、增加酯香成分的方法，其包括如下步骤：

步骤1，选择原料：选择无虫蛀、无霉变的高粱；

步骤2，制备麸曲：制备黑曲霉CICC2137麸曲和黑曲霉AS3.4309麸曲；

步骤3，粉碎原料：将高粱粉碎至每粒高粱分为4-6瓣；

步骤4，润料和蒸料：按照高粱占水比例为30-40％向粉碎后的高粱中加水并在30-40℃的环境中润料2.5-3.5h，然后在90-110℃的温度下蒸煮50-70min得到蒸煮液，其中，蒸煮液中的高粱粒心不硬、呈粥状；

步骤5，糖化：待蒸煮液冷却至60-65℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2-2.67％的CICC2137麸曲和4-5.34％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50-60min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至28-35℃时继续加入占高粱比为30-40％的大曲进行二次糖化48-55min，得到糖化液；

步骤6，制备发酵剂：制备菌株LY14酵母发酵剂和菌株QY18裂殖酵母发酵剂；

步骤7，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在30-40℃的环境下发酵7-8d，得到发酵液。

可选地，所述步骤4中，按照高粱占水比例为33％向高粱中加水并在35℃的环境中润料3h，然后在100℃的温度下蒸煮60min，得到蒸煮液；

所述步骤5中，待蒸煮液冷却至60℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2.2％的CICC2137麸曲和4.4％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至30℃时继续加入占高粱比为33％的大曲进行二次糖化50min，得到糖化液；

所述步骤7中，向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在35℃的环境下发酵7d，得到发酵液。

可选地，所述步骤2中制备CICC2137麸曲的方法包括如下步骤：

步骤21，制备斜面试管：首先，取去皮马铃薯200g，切成1～2cm小方块后放入容器中，向容器中加入1000ml水后加热煮沸20～30min；然后，使用双层纱布过滤煮沸后的液体，向滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，待葡萄糖和琼脂全部溶化后，向滤液中加水补足蒸发掉的水分至1000ml并立即分装入多个试管中，其中，每个试管中的液体容量为8～10ml；接着，将每个试管塞上棉塞并用防潮纸包扎好，在压力为0.1Mpa、温度为121℃的条件下灭菌20min后，立即将灭菌结束后的试管摆放成斜面，待其中的液体冷却后成为斜面试管；

步骤22，制备CICC2137斜面菌种：用接种环挑取一环黑曲霉CICC2137菌种划线接入步骤21制备好的斜面试管中并在温度为37℃的条件下培养5天，待斜面试管表面形成大量有色孢子时，表明CICC2137斜面菌种制备完成；

步骤23，制备CICC2137麸曲：在洁净的三角瓶中加入15g麸皮和15ml水并进行搅拌，待搅拌均匀后将三角瓶的瓶口用棉塞或8层纱布包扎好后置于灭菌锅中并在121℃下灭菌20min，待灭菌锅压力表降至零时，取出三角瓶，趁热将三角瓶中的麸皮摇散；待三角瓶中的麸皮温度冷却至室温时，在超净工作台中用接种环挑取三环CICC2137斜面菌种试管中的CICC2137菌种接入三角瓶，用灭过菌的玻璃棒将其搅拌均匀后，使用8层纱布封口；将接菌后的三角瓶置于30℃下培养72h，期间从第二天起每天摇三角瓶一次，待三角瓶中表面菌丝茂盛时扣瓶培养；当三角瓶中的麸皮上菌丝表面出现浅色孢子时，停止培养；将三角瓶中的麸曲置于40℃的恒温干燥箱中干燥3h，得到CICC2137麸曲。

可选地，所述步骤2中制备AS3.4309麸曲的方法包括如下步骤：

步骤24，制备斜面试管：首先，取去皮马铃薯200g，切成1～2cm小方块后放入容器中，向容器中加入1000ml水后加热煮沸20～30min；然后，使用双层纱布过滤煮沸后的液体，向滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，待葡萄糖和琼脂全部溶化后，向滤液中加水补足蒸发掉的水分至1000ml并立即分装入多个试管中，其中，每个试管中的液体容量为8～10ml；接着，将每个试管塞上棉塞并用防潮纸包扎好，在压力为0.1Mpa、温度为121℃的条件下灭菌20min后，立即将灭菌结束后的试管摆放成斜面，待其中的液体冷却后成为斜面试管；

步骤25，制备AS3.4309斜面菌种：用接种环挑取一环黑曲霉AS3.4309菌种划线接入骤24制备好的斜面试管中并在温度为37℃的条件下培养5天，待斜面试管表面形成大量有色孢子时，表明AS3.4309斜面菌种制备完成；

步骤26，制备AS3.4309麸曲：在洁净的三角瓶中加入15g麸皮和15ml水并进行搅拌，待搅拌均匀后将三角瓶的瓶口用棉塞或8层纱布包扎好后置于灭菌锅中并在121℃下灭菌20min，待灭菌锅压力表降至零时，取出三角瓶，趁热将三角瓶中的麸皮摇散；待三角瓶中的麸皮温度冷却至室温时，在超净工作台中用接种环挑取三环AS3.4309斜面菌种试管中的AS3.4309菌种接入三角瓶，用灭过菌的玻璃棒将其搅拌均匀后，使用8层纱布封口；将接菌后的三角瓶置于30℃下培养72h，期间从第二天起每天摇三角瓶一次，待三角瓶中表面菌丝茂盛时扣瓶培养；当三角瓶中的麸皮上菌丝表面出现浅色孢子时，停止培养；将三角瓶中的麸曲置于40℃的恒温干燥箱中干燥3h，得到AS3.4309麸曲。

可选地，所述步骤6中制备菌株LY14酵母发酵剂和菌株QY18裂殖酵母发酵剂的方法包括如下步骤：

步骤61，制备斜面培养基试管：将酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、琼脂2g和蒸馏水100ml搅拌均匀后在115℃下灭菌20min，得到斜面培养基试管；

步骤62，制备液体培养基：将酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g和蒸馏水100ml搅拌均匀后在115℃下灭菌20min，得到液体培养基；

步骤63，制备菌株LY14酵母斜面菌种：用接种环从菌株LY14酵母斜面菌种试管中挑取一环菌体接入步骤61制备得到的斜面培养基试管中，于30℃恒温培养箱中培养48h活化，连续进行二次活化，得到菌株LY14酵母斜面菌种；

步骤64，制备菌株QY18裂殖酵母斜面菌种：用接种环从菌株QY18裂殖酵母斜面菌种试管中挑取一环菌体接入步骤61制备得到的另一斜面培养基试管中，于30℃恒温培养箱中培养48h活化，连续进行二次活化，得到菌株QY18裂殖酵母斜面菌种；

步骤65，制备菌株LY14酵母发酵剂：用接种环从菌株LY14酵母斜面菌种上挑取一环菌体接入含有100ml步骤62制备得到的液体培养基的三角瓶中，于30℃恒温培养箱中培养48h后，得到菌株LY14酵母发酵剂；

步骤66，制备菌株QY18裂殖酵母发酵剂：用接种环从菌株QY18裂殖酵母斜面菌种上挑取一环菌体接入含有100ml步骤62制备得到的液体培养基的三角瓶中，于30℃恒温培养箱中培养48h后，得到菌株QY18裂殖酵母发酵剂。

本发明的有益效果是：

(1)陈醋生产中酒精发酵阶段结束时酒精发酵液的酒精含量达到

13.82％vol，比目前生产(酒精发酵液的酒精含量10％vol)提高了38.2％，从而可以提高出醋率。

(2)酒精发酵阶段结束时发酵液中含有七种具陈醋特征性风味的物质，其相对含量分别是苯乙醇19.30％、乙酸乙酯10.55％、醋酸异戊酯0.99％、棕榈酸乙酯1.46％、油酸乙酯7.58％、2-甲基丁酸0.08％、苯乙醛0.06％；而按照原陈醋生产方法(仅使用大曲进行酒精发酵)，酒精发酵结束时发酵液中陈醋特征性风味物质只有五种，它们分别是苯乙醇1.83％、乙酸乙酯19.86％、醋酸异戊酯1.59％、棕榈酸乙酯0.02％、2-甲基丁酸0.32％。

(3)酒精发酵阶段结束时发酵液的总酯含量为0.732g·100mL^-1，比原陈醋酒精发酵阶段结束时发酵液的总酯含量(0.58g·100mL^-1)增加了26.2％。

因此，与背景技术相比，本发明具有既可以明显提高陈醋生产中酒精发酵阶段结束时发酵液的酒精含量，也可以同时增加发酵液中陈醋特征性风味物质的种类和发酵液的总酯含量，即增加酯香成分，为全面提高出品率和产品质量提供了物质基础，进而能够提高生产效益及陈醋的风味质量。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为料水比对还原糖含量的影响示意图。

图3为料水比对酒精度产量的影响示意图。

图4为麸曲和高粱的反应温度对还原糖含量的影响示意图。

图5为麸曲和高粱的反应时间对还原糖含量的影响示意图。

图6为大曲和高粱的反应温度对还原糖含量的影响示意图。

图7为大曲和高粱的反应时间对还原糖含量的影响示意图。

图8为糖化阶段的正交试验因素水平直观分析图。

图9为发酵温度对酒精度产量的影响示意图。

图10为发酵时间对酒精度产量的影响示意图。

图11为酒精发酵阶段的直观分析结果。

图12为最佳条件下发酵液挥发性香气成分GC-MS总离子流色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

如图1所示，本实施例中的陈醋生产中提高发酵液酒精度、增加酯香成分的方法，包括如下步骤1至步骤7：

步骤1，选择原料：选择无虫蛀、无霉变的高粱。

其中，高粱淀粉含量为62％-68％。

步骤2，制备麸曲：制备黑曲霉CICC2137麸曲和黑曲霉AS3.4309麸曲。

本发明实施例中，使用透明圈法从大曲中筛选得到具有较高淀粉酶活力的7株细菌和5株霉菌，经鉴定，细菌均为芽孢杆菌属(Bacillus)，编号为：X17、X4、X1、X7、X20、X5和X8；霉菌中编号M4、M13和M17的菌株为曲霉属(Eurotium)，M7的菌株为犁头霉属(Absidia)，M1的菌株为毛霉属(Mucor)。对这12个菌株和大曲分别进行淀粉酶系分析，分析结果见表1：

表1大曲中淀粉酶系活力测定结果

由表1可见，大曲的α-淀粉酶活力为1.540u/g，β-淀粉酶活力为215.622u/g，葡萄糖淀粉酶活力为816.815u/g，淀粉脱支酶活力为0.073u/g。与其它菌株相比，大曲的α-淀粉酶活力和淀粉脱支酶活力明显不高，这会导致对原料(高粱)淀粉的糖化不充分，糖化速度慢，可发酵性糖的转化率低，最终造成生产出醋率低和生产效益差的结果。因此，针对大曲淀粉酶系的不足，本发明实施例引用综合表现优秀的菌株制成麸曲来强化大曲，以使糖化充分、提高糖化速度和发酵性糖的糖的转化率，进而提高出醋率和和生产效益。

具体地，针对大曲淀粉酶系的不足，本发明实施例将综合表现优秀的黑曲霉AS3.4309、CICC2137和H308与大曲中的优势菌株制成的麸曲及大曲的淀粉酶系活力进行比较，比较结果见表2：

表2大曲及其优势菌株与引入的三种黑曲霉所制麸曲淀粉酶系活力测定结果

表2的结果表明，黑曲霉AS3.4309和黑曲霉CICC2137菌株制成的麸曲与大曲有较好的互补性。因此，本发明实施例在该步骤2中选择CICC2137和AS3.4309来强化大曲，因而本发明实施例需要制备CICC2137麸曲和AS3.4309麸曲。

可选地，步骤2制备CICC2137麸曲的方法包括如下步骤21至步骤23：

步骤21，制备斜面试管：首先，取去皮马铃薯200g，切成1～2cm小方块后放入容器中，向容器中加入1000ml水后加热煮沸20～30min；然后，使用双层纱布过滤煮沸后的液体，向滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，待葡萄糖和琼脂全部溶化后，向滤液中加水补足蒸发掉的水分至1000ml并立即分装入多个试管(试管型号为18×180mm)中，其中，每个试管中的液体容量为8～10ml；接着，将每个试管塞上棉塞并用防潮纸包扎好，在压力为0.1Mpa、温度为121℃的条件下灭菌20min后，立即将灭菌结束后的试管摆放成斜面，待其中的液体冷却后成为斜面试管。

步骤22，制备CICC2137斜面菌种：用接种环挑取一环黑曲霉CICC2137菌种划线接入步骤21制备好的斜面试管中并在温度为37℃的条件下培养5天，待斜面试管表面形成大量有色孢子时，表明CICC2137斜面菌种制备完成。

步骤23，制备CICC2137麸曲：在洁净的三角瓶(250ml)中加入15g麸皮和15ml水并进行搅拌，待搅拌均匀后将三角瓶的瓶口用棉塞或8层纱布包扎好后置于灭菌锅中并在121℃下灭菌20min，待灭菌锅压力表降至零时，取出三角瓶，趁热将三角瓶中的麸皮摇散；待三角瓶中的麸皮温度冷却至室温时，在超净工作台中用接种环挑取三环CICC2137斜面菌种试管中的CICC2137菌种接入三角瓶，用灭过菌的玻璃棒将其搅拌均匀后，使用8层纱布封口；将接菌后的三角瓶置于30℃下培养72h，期间从第二天起每天摇三角瓶一次，待三角瓶中表面菌丝茂盛时扣瓶培养；当三角瓶中的麸皮上菌丝表面出现浅色孢子时，停止培养；将三角瓶中的麸曲置于40℃的恒温干燥箱中干燥3h，得到CICC2137麸曲。

可选地，步骤2制备AS3.4309麸曲的方法包括如下步骤24至步骤26：

步骤24，制备斜面试管：首先，取去皮马铃薯200g，切成1～2cm小方块后放入容器中，向容器中加入1000ml水后加热煮沸20～30min；然后，使用双层纱布过滤煮沸后的液体，向滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，待葡萄糖和琼脂全部溶化后，向滤液中加水补足蒸发掉的水分至1000ml并立即分装入多个试管(试管型号为18×180mm)中，其中，每个试管中的液体容量为8～10ml；接着，将每个试管塞上棉塞并用防潮纸包扎好，在压力为0.1Mpa、温度为121℃的条件下灭菌20min后，立即将灭菌结束后的试管摆放成斜面，待其中的液体冷却后成为斜面试管。

步骤25，制备AS3.4309斜面菌种：用接种环挑取一环黑曲霉AS3.4309菌种划线接入骤24制备好的斜面试管中并在温度为37℃的条件下培养5天，待斜面试管表面形成大量有色孢子时，表明AS3.4309斜面菌种制备完成。

步骤26，制备AS3.4309麸曲：在洁净的三角瓶(250ml)中加入15g麸皮和15ml水并进行搅拌，待搅拌均匀后将三角瓶的瓶口用棉塞或8层纱布包扎好后置于灭菌锅中并在121℃下灭菌20min，待灭菌锅压力表降至零时，取出三角瓶，趁热将三角瓶中的麸皮摇散；待三角瓶中的麸皮温度冷却至室温时，在超净工作台中用接种环挑取三环AS3.4309斜面菌种试管中的AS3.4309菌种接入三角瓶，用灭过菌的玻璃棒将其搅拌均匀后，使用8层纱布封口；将接菌后的三角瓶置于30℃下培养72h，期间从第二天起每天摇三角瓶一次，待三角瓶中表面菌丝茂盛时扣瓶培养；当三角瓶中的麸皮上菌丝表面出现浅色孢子时，停止培养；将三角瓶中的麸曲置于40℃的恒温干燥箱中干燥3h，得到AS3.4309麸曲。

步骤3，粉碎原料：将高粱粉碎至每粒高粱分为4-6瓣。

步骤4，润料和蒸料：按照高粱占水比例为30-40％向粉碎后的高粱中加水并在30-40℃的环境中润料2.5-3.5h，然后在90-110℃的温度下蒸煮50-70min得到蒸煮液，其中，蒸煮液中的高粱粒心不硬、呈粥状。

如图2所示，其为料水比(高粱与水的比例)对还原糖含量的影响示意图。由图2可得，糖化初始阶段随着原料的增加，还原糖的含量不断增加，当原料与水的比例为30％(即30∶100)时还原糖含量最高，达到18.86g/100mL，此后，还原糖的含量又有一定的下降趋势，可能是因为淀粉转化为还原糖到一定的浓度后发生逆反应造成。

如图3所示，其为料水比对酒精度产量的影响示意图。由图3可知，随着料水比的增加，酒精度产量不断提高，在30-40％之间没有明显的变化，继续添加高粱就会造成原料浪费。

综上，本发明实施例中润料时选择高粱占水的比例为30-40％。

另外，润料时的温度、润料时间及蒸煮温度、蒸煮时间的设置均是为了保证蒸煮后的高粱的粒心不硬并呈粥状。

步骤5，糖化：待蒸煮液冷却至60-65℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2-2.67％的CICC2137麸曲和4-5.34％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50-60min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至28-35℃时继续加入占高粱比为30-40％的大曲进行二次糖化48-55min，得到糖化液。

如图4所示，其为麸曲(CICC2137麸曲和AS3.4309麸曲)和高粱的反应温度对还原糖含量的影响示意图。由图4可知，麸曲和原料的反应在45℃之前很缓慢，45℃之后转化淀粉为还原糖的能力逐渐变强，在60℃时反应最为剧烈，对淀粉的糖化效果最为显著；在65℃时还原糖的含量开始有下降的趋势。因此，本发明实施例中选择麸曲与高粱的反应温度为60-65℃，此时转化淀粉为还原糖的能力比较强。

如图5所示，其为麸曲和高粱的反应时间对还原糖含量的影响示意图。由图5可知，在麸曲和高粱反应50min时达到产还原糖的饱和值，此时的麸曲转化淀粉为还原糖的能力已充分发挥，在此之后的还原糖含量不再有明显的增长并保持在一定的含量范围内。在实际的生产中，出于对时间和经济成本的考虑，本发明实施例选择麸曲与高粱反应50-60min时结束麸曲对原料的糖化反应，即结束一次糖化。

如图6所示，其为大曲和高粱的反应温度对还原糖含量的影响示意图。由图6可知，在30℃还原糖含量达到19.46g/100mL，35℃以后还原糖含量开始明显下降，说明此时的温度已不利于大曲中微生物菌群生长，开始出现衰退。因此，本发明实施例选择大曲与高粱反应温度为28℃-35℃之间，此区间分解还原糖的微生物菌群适宜生长，还原糖含量最高。

如图7所示，其为大曲和高粱的反应时间对还原糖含量的影响示意图。由图7可知，在大曲和高粱反应50min时达到产还原糖的饱和值，此时的淀粉得到充分的利用，在此之后的还原糖含量不再有明显的增长并保持在一定的含量范围内。在实际的生产中，出于对时间和经济成本的考虑，可以在48-55min时结束大曲和原料的糖化反应。

为了确定AS3.34309麸曲、CICC2137麸曲和大曲的配比，本发明实施例对AS3.34309麸曲和CICC2137麸曲进行0、3％、6％、9％四个不同比例添加量与不同比例添加量的大曲进行配比组合正交试验来确定它们之间的最佳比例，其因素水平表见表3，大曲配比组合正交试验结果见表4，试验结果的方差分析结果见表5，因素水平分析结果见图8。

表3正交试验因素水平表

注：麸曲1代表CICC2137麸曲，麸曲2代表AS3.4309麸曲。

表4正交实验结果

表5试验结果的方差分析

由表4、图8和表5的正交试验所得数据可知，三种因素对还原糖的影响次序为：B(麸曲2添加量)>A(麸曲1添加量)>C(大曲添加量)，B麸曲2添加量极差最大且对还原糖的影响达到了显著水平，说明B因素对还原糖的影响最大，其中以第3水平最好；极差最小的为C，说明这三个因素中大曲添加量对还原糖的影响最小。通过数据分析，得到最优方案为A2B3C3，即高粱糊化后(蒸煮液)加入占高粱比为3％的麸曲1、6％的麸曲2和55％的大曲，产生的还原糖最高，经测定，还原糖含量达到21.16g/100ml。进一步分析，发现C因素中K2为18.245g/100mL，K3为18.350g/100mL，二者极为接近，且C因素对还原糖含量影响最小。出于对实际生产成本的考虑，选择A2B3C2，即高粱糊化后加入占高粱比为3％的麸曲1、6％的麸曲2和45％的大曲。进行验证试验，结果为：还原糖的含量达20.84g/100ml，和正交试验得出的最优方案相比，此方案所得还原糖含量与之差距很小，与理论数据吻合。

综上，本发明实施例中确定CICC2137麸曲、AS3.4309麸曲和大曲的配比为3︰6︰45，此方案产生的还原糖达到20.84g/100ml，而高粱在刚蒸煮好后测其还原糖含量为8.60g/100ml，还原糖含量提高两倍以上。上述步骤5中的配比关系与该结论相吻合。

步骤6，制备发酵剂：制备菌株LY14酵母发酵剂和菌株QY18裂殖酵母发酵剂。

本发明实施例从大曲、酒醪中分离得到68株具有典型酵母菌特征的菌株。各组中挑选1株代表菌株，共计12株，分别命名为：LY01、LY12、LY14、LY23、LY27、QY03、QY07、QY13、QY15、QY17、QY18和QY20。根据酵母菌的形态特征与生理生化特性，分离所得12株酵母菌鉴定结果为：LY01和QY13为汉逊酵母属(Hansenula)；LY23和QY15为克勒克酵母属(Kloeckera)；LY12、LY14和LY27为酵母属(Saccharomyces)；QY03、QY17、QY20为假丝酵母属(Candida)；QY07为毕赤酵母属(Pichia)；QY18为裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

通过研究具有代表性的12株酵母菌株生产性能，可知大曲、酒醪中的酵母菌株是复杂的，具有多样性的，其中既有产酒酵母也有产香酵母。其中，菌株LY14和QY15产酒精能力强，产酒精度分别为9.2％vol和9.4％vol；菌株LY01、LY12、LY23、QY13和QY18产酯能力突出，产酯量分别为0.667g·100mL-1、0.701g·100mL-1、0.718g·100mL-1、0.783g·100mL-1和0.686g·100mL-1。相反，菌株LY23和QY13产酒精能力弱，产酒精度分别为6.1％vol和5.3％vol；菌株LY14、LY27、QY03、QY07、QY15、QY17和QY20产酯能力低弱，且产酯含量均高于对照菌株SHY(0.584g·100mL-1)。除此之外，菌株LY14、LY27和QY15耐酒精性能高，可耐受酒精度为15％vol；菌株QY07和QY13耐酒精性能低，可耐酒精度为9％vol，其余菌株可耐酒精度为13％vol。菌株LY01、LY12、LY14、LY23、LY27和QY15产酒速度由快变慢；其余菌株的产酒速度是由慢变快再变慢。

本发明实施例进一步实验采用GC-MS方法对高产酯菌株LY01、LY12、LY23、QY13和QY18的发酵液中的挥发性成分进行分析，以大曲发酵液为阳性对照，菌株SHY发酵液为阴性对照。根据风味物质的类别分类，通过峰面积归一化法计算出各样品中风味物质的相对含量，七种高粱发酵液中检测出香气成分93种，其中相同成分有7种，包括醇类3种，分别是乙醇、正戊醇和苯乙醇，酯类4种，分别是醋酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯和壬酸乙酯。7种发酵液分别鉴定出香气物质50种、38种、40种、36种、36种、35种、32种。其中大曲发酵液中香气成分占总挥发性成分的96.83％，其余分别99.45％、99.11％、99.35％、99.48％、99.63％、99.95％。大曲发酵液中香气成分占总挥发性成分含量最少，可能因为大曲是自然微生物培养得到的，菌类复杂。7种不同发酵液中检出具有食醋特征性风味的物质分别为5种、6种、5种、5种、5种、7种、4种，其中菌株QY18发酵液中检出具有食醋特征性风味的物质最多，分别为苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸和苯乙醛，相对含量分别为3.86％、22.79％、20.27％、0.07％、0.01％、0.14％和0.01％。本研究可为陈醋生产的菌种选用及工艺改良提供依据。

结合陈醋生产中对产酯和产酒的需求及上述分析，本发明实施例中在发酵时除采用大曲外，还采用菌株LY14酵母发酵剂和菌株QY18裂殖酵母发酵剂进行发酵。

可选地，所述步骤6中制备菌株LY14酵母发酵剂和菌株QY18裂殖酵母发酵剂的方法包括如下步骤61至步骤66：

步骤61，制备斜面培养基试管：将酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、琼脂2g和蒸馏水100ml搅拌均匀后在115℃下灭菌20min，得到斜面培养基试管；

步骤62，制备液体培养基：将酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g和蒸馏水100ml搅拌均匀后在115℃下灭菌20min，得到液体培养基。

步骤63，制备菌株LY14酵母斜面菌种：用接种环从菌株LY14酵母斜面菌种试管中挑取一环菌体接入步骤61制备得到的斜面培养基试管中，于30℃恒温培养箱中培养48h活化，连续进行二次活化，得到菌株LY14酵母斜面菌种。

步骤64，制备菌株QY18裂殖酵母斜面菌种：用接种环从菌株QY18裂殖酵母斜面菌种试管中挑取一环菌体接入步骤61制备得到的另一斜面培养基试管中，于30℃恒温培养箱中培养48h活化，连续进行二次活化，得到菌株QY18裂殖酵母斜面菌种。

步骤65，制备菌株LY14酵母发酵剂：用接种环从菌株LY14酵母斜面菌种上挑取一环菌体接入含有100ml步骤62制备得到的液体培养基的三角瓶中，于30℃恒温培养箱中培养48h后，得到菌株LY14酵母发酵剂。

步骤66，制备菌株QY18裂殖酵母发酵剂：用接种环从菌株QY18裂殖酵母斜面菌种上挑取一环菌体接入含有100ml步骤62制备得到的液体培养基的三角瓶中，于30℃恒温培养箱中培养48h后，得到菌株QY18裂殖酵母发酵剂。

步骤7，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在30-40℃下发酵7-8d，得到发酵液。

如图9所示，其为发酵温度对酒精度产量的影响示意图。由图9可以看出，在35℃时酒精度的产量达到12.1％vol，35℃以后酒精度的产量开始下降，说明此时的温度已不利于菌体生长，菌体开始出现衰退。经过分析可知，在30℃-40℃的范围之间时，菌体生长最快，酒精度产量较高。因此，本发明实施例选择发酵温度为30-40℃。

如图10所示，其为发酵时间对酒精度产量的影响示意图。由图10可以看出，在发酵初期(前7d内)，酒精含量随着时间的延长不断提高，且差异显著。随着发酵时间的延长，在7-9d酒精度产量开始出现平稳。此时菌体已经到了衰亡阶段，因此停止发酵。出于时间成本考虑，本发明实施例选择酒精发酵时间为7-8d。

另外，本发明实施例对产酒最佳菌种配比进行了研究，如表6所示，其为对产酒最佳菌种配比进行正交试验分析，分析结果见表6。

表6产酒最佳菌种配比正交试验结果

由表6正交试验数据进行极差分析得知，理论上的最优组合为A4B3C2，即大曲接种量:菌株LY14接种量:菌株QY18接种量＝60:6:3，经极差分析可知，RA>RB>RC，因此，影响产酒能力大小的因素依次为：A>B>C，即大曲的接种量>菌株LY14的接种量>菌株QY18的接种量。A因素的极差最大，说明大曲的接种量对产酒能力的影响作用很大；其次是菌株LY14的接种量；菌株QY18的接种量极差最小，说明菌株QY18的接种量对产酒能力的影响最小。由于本次组合A4B3C2即A:B:C＝60:6:3在上述试验中出现过，再次通过验证试验得出在此条件下酒精度为14.55％vol。

根据表6的结论进行方差分析，得出方差分析表见表7。

表7方差分析表

注：“*”为显著；“**”为极显著。

根据表7的检验结果表明：大曲的接种量、菌株LY14的接种量对酒精的产量有着显著的影响；菌株QY18的接种量对酒精产量的影响不显著；因此，各因素对试验指标影响的主次顺序为A、B、C。

进一步地，对因素A、B、C进行直观分析，直观分析结果见图11，图11采用直观分析法对各因素水平进行直观比较。由图11因素直观比较结果表明A因素中A4差异显著，且均优于A1、A2、A3，因此，选择A1即可；B因素中B3略优于B4，且差异显著于B1、B2，因此选择B3；C因素中C2优于C1、C3、C4且差异显著不明显，因此选择C2。

从以上分析得知，为提高产酒能力3个试验因素的最优水平组合为A4B3C2，即大曲接种量:菌株LY14接种量:菌株QY18接种量＝60:6:3。

另外，本实验在对上面酒精发酵的单因素试验的基础上，利用因子筛选(PB)试验进行显著因子的筛选，采取组数为12组，水平为2的试验设计，对料水比(A)、接种量(B)、pH(C)、发酵温度(D)、发酵时间(E)等5个因素进行考察，试验设计与结果见表8，对PB试验进行方差分析的结果见表9。

表8Plackett-Burman实验设计与结果

根据试验数据，拟合得到的方程为：T＝10.408+0.425A+0.792B+0.292C+0.225D+0.625E。通过Minitab18软件进行方差分析可知，在研究的整个回归区域内，该模型拟合性较好，判定系数R2＝0.9332，说明影响酒精度发酵的主要因素筛选试验中，93.32％的数据可由此模型解释，试验结果较准确。

表9Plackett-Burman实验方差分析

由表9的方差分析可知，三个因素P(A)＝0.015、P(B)＝0.001、P(E)＝0.003，其P值均小于0.05。因此，本发明实施例选择料液比、接种量、发酵时间继续进行响应面试验。

响应面试验设计是利用因子筛选的结果进行进一步的试验优化的设计方案，筛选结果得出的三个显著因子，即料水比(A)、接种量(B)、发酵时间(C)，响应面实验设计与结果见表10，其方差分析结果见表11。

表10响应面实验设计与结果

表11响应面实验方差分析

注：“*”为显著；“**”为极显著。

由表11方差分析可知，模型失拟项不显著(P＝0.0648>0.05)，说明拟合方程不失拟，回归模型极显著(P<0.0001<0.01)，模型的相关系数R2为99.80％，说明该模型能够很好的拟合实验结果，因此回归方程给高粱的发酵提供了一个合适的模型。从方差分析表中还可以看出方程的一次项中A(料液比)(P<0.0001<0.01)、B(接种量/％)(P<0.0001<0.05)、C(发酵实时间/d)(P＝0.0023<0.01))影响极显著，而A2、B2影响极显著。这说明料液比、接种量、发酵时间这三个因素都是在发酵过程中需要主要控制的因素。模型交互项影响中，AB(P＝0.0003<0.01)影响极显著，AC(P＝0.0275<0.05)、BC(P＝0.0456<0.05)影响显著，说明影响高粱发酵工艺的三个因素之间对发酵工艺有明显的交互作用。

应用Design Expert8.0.6软件进行多元回归拟合分析，得出发酵工艺各因素变量的二次方程模型为：

Y＝12.88+1.46*A+1.75*B+0.24*C+0.48*A*B-0.20*A*C-0.17*B*C-1.61*A2-1.89*B2-0.12*C2

经过响应面软件分析得到优化的结果为：料水比为32.59:100、接种量为45.19％、发酵时间为7.18d。为实际操作方便，修正最佳发酵工艺条件为：料水比为33:100、接种量为45％、发酵时间为7d。

进一步地，利用Design-expert8.0.6软件进行响应面试验，通过优化得知：料水比为32.59:100、接种量为45.19％、发酵时间为7.18d，得到的最佳酒精度理论产量13.74％vol。为了检验模型预测的准确性，在最佳条件料水比为33:100、接种量为45％、发酵时间为7d下进行发酵验证。测得酒精度平均值为13.82％vol，与模型较吻合，说明该模型可以较好地预测发酵情况，具有实际的应用价值。

在此基础上，本发明实施例对最佳条件下高粱发酵液生产性能测定分析，经过3次的重复性验证试验，分别测定了酒精度、总酯、还原糖，结果见表12。

表12最佳条件高粱发酵液生产性能指标

本发明实施例还对最佳条件下高粱发酵液挥发性香气成分分析。具体地，采用GC-MS测定最佳条件下高粱发酵液挥发性香气成分，根据风味物质的类别分类，通过峰面积归一化法计算出各样品中风味物质的相对含量，色谱图见图12。图12为最佳条件下发酵液挥发性香气成分GC-MS总离子流色谱图。

其中，高粱发酵液中共检测出了46种香气成分，主要包括醇、酯、酸、醛、酮、烷烃、烯烃和杂环类化合物，分别为6种、26种、3种、3种、2种、4种、1种和1种，其中醇类(50.08％)、酯类(34.71％)、酸类(11.99％)的相对含量较高，其他它类的相对含量较低。其中正戊醇(20.21％)含量最高，检出7种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、2-甲基丁酸、和苯乙醛。

如表13所示，其为不同菌群高粱发酵液食醋特征香气成分比较表。从表13可以看出，不同菌群的高粱发酵液，其食醋特征香气成分含量不同。这些特征香气成分都具有自己特殊的风味。苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香；乙酸乙酯具有水果香气；醋酸苯乙酯具有玫瑰花香和蜂蜜样香气，味甜，能让醋的口感变佳；醋酸异戊酯具有较强的新鲜果香，稍甜，是生梨、香蕉的主要香气成分之一；棕榈酸乙酯具有微弱蜡香、果爵和奶油香气；油酸乙酯具有鲜花香气；2-甲基丁酸具有果香、奶酪香气；苯乙醛具浓郁的玉簪花香、玫瑰、壤香及巧克力香气。

最佳菌群混合发酵是指由大曲、产酒酵母菌株LY14和产香酵母菌株QY18按照一定的比例混合发酵而成的发酵液。由表13中可以得出，最佳菌群混合高粱发酵液中苯乙醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醛相对含量均明显高于单菌株发酵液，并且油酸乙酯在单菌株发酵液中没有检出，但是在单菌株发酵液中乙酸乙酯和醋酸异戊酯的相对含量高于最佳菌群混合发酵液，且在菌株QY18发酵液中相对含量高的醋酸苯乙酯在最佳菌群混合发酵液中并未检出，未检出的原因可能是像苯乙醇、乙酸乙酯这样的挥发性香气物质生产量较高，竞争性占据了萃取头的位置，导致醋酸苯乙酯未被吸附上。

综上，从苯乙醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醛等特征性风味物质角度考虑，本工艺最佳菌群混合发酵液的香气成分优于单菌株发酵。

表13不同菌群高粱发酵液食醋特征香气成分比较

注：“-”表示没有检出。

综上，本发明实施例在在单因素试验的基础上对影响发酵的因素进行PB试验，经过筛选得到三个显著因子，分别为料液比(P＝0.015<0.05)、接种量

(P＝0.001<0.05)和发酵时间(P＝0.003<0.05)。根据PB试验筛选出的3个因素进行响应面试验，最终得到酒精发酵阶段的发酵最佳工艺为：料液比33:100，接种量45％，发酵时间7d，pH自然(其值为6)，发酵温度35℃，经过响应面优化工艺得到酒精度产量为13.82％vol、总酯产量为0.732g·100mL-1，剩余还原糖为0.86g·100mL-1。在此条件下的发酵液检出7种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、2-甲基丁酸和苯乙醛。综上所述，菌群混合发酵优于单菌株发酵。

综上，采用本发明实施例提供的方法有如下有益效果：

(1)陈醋生产中酒精发酵阶段结束时酒精发酵液的酒精含量达到

13.82％vol，比目前生产(酒精发酵液的酒精含量10％vol)提高了38.2％，从而可以提高出醋率。

(2)酒精发酵阶段结束时发酵液中含有七种具陈醋特征性风味的物质，其相对含量分别是苯乙醇19.30％、乙酸乙酯10.55％、醋酸异戊酯0.99％、棕榈酸乙酯1.46％、油酸乙酯7.58％、2-甲基丁酸0.08％、苯乙醛0.06％；而按照原陈醋生产方法(仅使用大曲进行酒精发酵)，酒精发酵结束时发酵液中陈醋特征性风味物质只有五种，它们分别是苯乙醇1.83％、乙酸乙酯19.86％、醋酸异戊酯1.59％、棕榈酸乙酯0.02％、2-甲基丁酸0.32％。

(3)酒精发酵阶段结束时发酵液的总酯含量为0.732g·100mL-1，比原陈醋酒精发酵阶段结束时发酵液的总酯含量(0.58g·100mL-1)增加了26.2％。

因此，采用本发明实施例提供的方法既可以明显提高陈醋生产中酒精发酵阶段结束时发酵液的酒精含量，也可以同时增加发酵液中陈醋特征性风味物质的种类和发酵液的总酯含量，即增加酯香成分，为全面提高出品率和产品质量提供了物质基础，进而能够提高生产效益及陈醋的风味质量。

实施例2：

本发明实施例的原理及过程与实施例1中基本相同，下面仅介绍该实施例与实施例1的区别。具体地，在该实施例中：

所述步骤4中，按照高粱占水比例为33％向高粱中加水并在35℃的环境中润料3h，然后在100℃的温度下蒸煮60min，得到蒸煮液。

所述步骤5中，待蒸煮液冷却至60℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2.2％的CICC2137麸曲和4.4％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至30℃时继续加入占高粱比为33％的大曲进行二次糖化50min，得到糖化液。

所述步骤7中，向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在35℃的环境下发酵7d，得到发酵液。

实施例3：

本发明实施例的原理及过程与实施例1中基本相同，下面仅介绍该实施例与实施例2的区别。具体地，在该实施例中：

所述步骤4中，按照高粱占水比例为32.6％向高粱中加水并在35℃的环境中润料3h，然后在100℃的温度下蒸煮60min，得到蒸煮液。

所述步骤7中，向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在35℃的环境下发酵7.18d，得到发酵液。

实施例4：

本发明实施例的原理及过程与实施例1中基本相同，下面仅介绍该实施例与实施例1的区别。具体地，在该实施例中：

所述步骤4中，润料和蒸料：按照高粱占水比例为30％向粉碎后的高粱中加水并在30℃的环境中润料2.5h，然后在90℃的温度下蒸煮50min得到蒸煮液；

所述步骤5中，糖化：待蒸煮液冷却至60℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2％的CICC2137麸曲和4％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至28℃时继续加入占高粱比为30％的大曲进行二次糖化48min，得到糖化液；

所述步骤7中，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在30℃的环境下发酵7d，得到发酵液。

实施例5：

所述步骤4中，润料和蒸料：按照高粱占水比例为40％向粉碎后的高粱中加水并在40℃的环境中润料3.5h，然后在110℃的温度下蒸煮70min得到蒸煮液；

所述步骤5中，糖化：待蒸煮液冷却至65℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2.67％的CICC2137麸曲和4-5.34％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化60min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至28-35℃时继续加入占高粱比为40％的大曲进行二次糖化55min，得到糖化液；

所述步骤7中，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在40℃的环境下发酵7-8d，得到发酵液。

实施例6：

所述步骤4中，润料和蒸料：按照高粱占水比例为35％向粉碎后的高粱中加水并在35℃的环境中润料3h，然后在100℃的温度下蒸煮60min得到蒸煮液；

所述步骤5中，糖化：待蒸煮液冷却至62℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2.3％的CICC2137麸曲和4.6％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化55min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至31℃时继续加入占高粱比为35％的大曲进行二次糖化51min，得到糖化液；

所述步骤7中，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在35℃的环境下发酵7-8d，得到发酵液。

实施例7：

所述步骤4中，润料和蒸料：按照高粱占水比例为32％向粉碎后的高粱中加水并在33℃的环境中润料3h，然后在92℃的温度下蒸煮55min得到蒸煮液；

所述步骤5中，糖化：待蒸煮液冷却至65℃时，向蒸煮液中加入占高粱比为2.2％的CICC2137麸曲和4.4％的AS3.4309麸曲，进行一次糖化50min，一次糖化结束后待蒸煮液的温度下降至35℃时继续加入占高粱比为40％的大曲进行二次糖化48min，得到糖化液；

所述步骤7中，酒精发酵：向糖化液中加入占高粱比为4％的菌株LY14酵母发酵剂和占高粱比为2％的菌株QY18裂殖酵母发酵剂，在30℃的环境下发酵8d，得到发酵液。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。