本发明涉及蛋白酶提取领域，具体而言，涉及一种植物蛋白酶提取方法及制得的植物蛋白酶。
背景技术：
植物蛋白酶对蛋白质具有高效专一的分解特性，可用于蛋白质的水解、肉类嫩化、啤酒澄清、海产品加工、制备洗涤剂和化妆品，某些植物蛋白酶如木瓜蛋白酶本身具有药理作用，可用于治疗炎症和消化不良。因此，植物蛋白酶在食品、日化以及医药领域存在广泛的应用。植物蛋白酶提取工艺，尤其是工业提取方法的改进，具有重要意义。
目前，植物蛋白酶的提取纯化方法较多，而能够进行工业化生产的植物蛋白酶提取方法主要有三种：高岭土吸附法、单宁沉淀法以及絮凝法。
其中，高岭土吸附法的主要工艺流程如说明书附图图1所示。如图1所示，高岭土吸附法的生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，高岭土和盐析工艺对环境造成污染，酶活总回收率低，但产品质量较好，纯度较高，产品如木瓜蛋白酶的酶活力在4.0×106U/g以上，可达到医药级。由于加入了高岭土并使用盐析工艺，对环境造成污染环保投资较大。
单宁沉淀法的主要工艺流程如说明书附图图2所示。单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单，原材料消耗少，所需设备少，但酶活回收率较低，产品如木瓜蛋白酶的酶活力3.5×106～4.0×106U/g之间，部分产品可达到食品级。同时，由于在生产中加入单宁，对环境造成污染，环保投资较大。
絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物，从而使酶从溶液中沉淀析出。
何继芹等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白酶。实验结果表明，在适宜的条件下进行絮凝处理，可使木瓜蛋白酶在这步的收率达95～97％。但这种方法提取专一性不强，制得的木瓜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高。
由此可见，现有的植物蛋白酶提取方法存在工艺复杂、对环境污染大、酶活和纯度不高的缺陷。本领域亟待对现有的植物蛋白酶提取方法进行改进，以期获得一种工艺简单、无污染、酶活和纯度高、可工业化的植物蛋白酶提取方法。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种植物蛋白酶提取方法，所述方法具有工艺简单、对环境无污染、可规模化工业生产、蛋白酶的酶活与纯度好等优点。
本发明的第二目的在于提供一种由前述提取方法制得的植物蛋白酶，所述植物蛋白酶具有活性好、纯度高、无溶剂残留的优点，达到食品、日化和医药工业的使用要求。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种植物蛋白酶提取方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将植物的浆液或粉碎物与水按料液比1:5～20混合后进行水提取，收集提取液；
(2)所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为100～150目，所述陶瓷膜的孔径大小为50～200nm；
(3)使用截留分子量为30～100KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为5～15KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
(4)所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得植物蛋白酶。
如说明书附图图3所示，与常规的植物蛋白酶提取方法不同，本发明所述方法全程使用膜处理，其中包括使用板框压滤机进行固液分离，使用陶瓷膜进行澄清和除菌处理，以及使用超滤膜进行超滤处理。膜处理方式对蛋白的处理方式温和，在分离纯化过程中不会造成植物蛋白酶失活，蛋白酶的损耗小，提取物的酶活高。同时，膜处理方式在分离纯化过程中不会引入有机溶剂或其他杂质，因此，制得的植物蛋白酶无有机溶剂残留，品质高，可直接用于食品、日化和医药领域。另外，本发明所述方法无需使用高岭土、单宁，不会对环境造成污染，属于环保型提取方法。再者，本发明所述方法先后使用两种不同截留分子量的超滤膜进行超滤处理，可以将提取液中的大分子杂蛋白和小分子杂质都去除，纯化效果好。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，在进行水提取时，混合液中加入包括苯甲酸钠和EDTA-2Na的酶保护剂，所述苯甲酸钠和所述EDTA-2Na在所述混合液中的质量分数均为0.1％～0.2％。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述苯甲酸钠和所述EDTA-2Na在所述混合液中的质量分数均为0.15％。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，步骤(3)中，第一次超滤处理使用的是截留分子量为40～60KDa的超滤膜，第二次超滤处理使用的是截留分子量为7～12KDa的超滤膜。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，步骤(3)中，第一次超滤处理使用的是截留分子量为50KDa的超滤膜，第二次超滤处理使用的是截留分子量为10KDa的超滤膜。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶选自木瓜蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、无花果蛋白酶、罗汉果蛋白酶或菠萝蛋白酶。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶为木瓜蛋白酶，步骤(1)中与水混合的物料为木瓜浆液，所述木瓜浆液与水的料液比为1:7～12优选1:10，水提取方式为搅拌反应1～2h，优选搅拌反应1.5h。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶为罗汉果蛋白酶，所述步骤(1)中，罗汉果汁与水的料液比为1:5～10，优选为1:7，水提取方式为搅拌反应1～2h，优选搅拌反应1.5h。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶为无花果蛋白酶，所述步骤(1)中，无花果粉碎物与pH＝4～5、质量分数为0.5％～1.2％的NaCl水溶液按料液比1:10～20混合；
优选地，无花果粉碎物与pH＝4.5、质量分数为0.9％的NaCl水溶液按料液比1:15混合。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶为猕猴桃植物蛋白酶，所述步骤(1)具体包括：将猕猴桃果粉碎物与pH＝4～5、质量分数为22～25％的NaCl水溶液按料液比1:4～7混合，搅拌反应1～2h，低温沉淀4～8h后固液分离，所得固相物质用pH＝6～8的缓冲液复溶，即得提取液；
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述步骤(1)具体包括：将猕猴桃果粉碎物与pH＝4～5、质量分数为24％的NaCl水溶液按料液比1:5混合，搅拌反应1.5h，低温沉淀6h后固液分离，所得固相物质用pH＝7的缓冲液复溶，即得提取液。
优选地，在如上所述的植物蛋白酶提取方法中，所述植物蛋白酶为菠萝植物蛋白酶，步骤(1)中，菠萝粉碎物与水按料液比1:7～12优选1:10混合，水提取方式为搅拌反应1～2h，优选搅拌反应1.5h。
本发明所述方法还对木瓜蛋白酶、罗汉果蛋白酶、无花果蛋白酶、猕猴桃蛋白酶和菠萝蛋白酶的具体提取方法进行进一步优化，其中，在提取无花果蛋白酶和猕猴桃蛋白酶时采用酸性的NaCl水溶液进行处理，可以显著提高蛋白酶的提取效果，其中，提取无花果蛋白酶时，水溶液中低浓度的NaCl主要起到保持酶活的作用，而提取猕猴桃蛋白酶时，水溶液中高浓度的NaCl主要起到在水提结束后促进猕猴桃蛋白酶低温沉淀的作用。综上所述，本发明上述方法对植物蛋白酶的具体提取工艺进行优化，优化后的提取方法具有提取率和酶活更高的特点。
本发明还涉及由前述方法制成的植物蛋白酶。本发明所述植物蛋白酶具有所述植物蛋白酶具有活性好、纯度高、无溶剂残留的优点，达到食品、日化和医药工业的使用要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述植物蛋白酶提取方法具有工艺简单、对环境无污染、可规模化工业生产、蛋白酶的酶活与纯度好等优点。
(2)本发明所述方法对具体的提取工艺进行优化，优化后的提取方法具有提取率和酶活更高的特点。
(3)本发明所述植物蛋白酶具有活性好、纯度高、无溶剂残留的优点，达到食品、日化和医药工业的使用要求
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为高岭土吸附法生产植物蛋白酶的工艺流程图；
图2为单宁沉淀法生产植物蛋白酶的工艺流程图；
图3为本发明所述方法生产植物蛋白酶的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
一种木瓜蛋白酶的提取方法，所述方法由以下步骤组成：
将木瓜浆与工艺水按料液比1:10混合，加入酶保护剂苯甲酸钠和EDTA-2Na，所述苯甲酸钠和所述EDTA-2Na在所述混合液中的质量分数均为0.1％～0.2％，搅拌反应1.5h，即得提取液；
所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为150目，所述陶瓷膜的孔径大小为50nm；
使用截留分子量为50KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为10KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得木瓜蛋白酶。
实施例2
一种罗汉果蛋白酶的提取方法，所述方法由以下步骤组成：
新鲜罗汉果洗净，破碎，离心去渣后获得罗汉果汁，将罗汉果汁与工艺水按料液比1:10混合，搅拌反应1.5h，即得提取液；
所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为150目，所述陶瓷膜的孔径大小为200nm；
使用截留分子量为50KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为10KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得罗汉果蛋白酶。
实施例3
一种猕猴桃蛋白酶的提取方法，所述方法由以下步骤组成：
将经粉碎的猕猴桃果与pH＝4.5、质量分数为24％的NaCl水溶液按料液比1:5混合，搅拌反应1.5h，低温沉淀6h后固液分离，所得固相物质用pH＝7的缓冲液复溶，即得提取液；
所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为100目，所述陶瓷膜的孔径大小为100nm；
使用截留分子量为50KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为10KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得猕猴桃蛋白酶。
实施例4
一种无花果蛋白酶的提取方法，所述方法由以下步骤组成：
将粉碎的无花果青果与与pH＝4.5、质量分数为0.9％的NaCl水溶液按料液比1:15混合，搅拌反应1.5h，即得提取液；
所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为100目，所述陶瓷膜的孔径大小为100nm；
使用截留分子量为50KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为10KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得无花果蛋白酶。
实施例5
一种菠萝蛋白酶的提取方法，所述方法由以下步骤组成：
将粉碎后的菠萝根茎与工艺水水按料液比1:10混合，加入酶保护剂苯甲酸钠和EDTA-2Na，所述苯甲酸钠和所述EDTA-2Na在所述混合液中的质量分数均为0.1％～0.2％，搅拌反应1.5h，即得提取液；
所得提取液依次通过板框压滤机和陶瓷膜过滤，所述板框压滤机的滤布孔径大小为100目，所述陶瓷膜的孔径大小为200nm；
使用截留分子量为50KDa的超滤膜对所述滤液进行第一次超滤处理，收集滤液，使用截留分子量为10KDa的超滤膜对所述滤液进行第二次超滤处理，收集截留液；
所述截留液经浓缩获得浓缩液，所述浓缩液经冷冻干燥即得菠萝蛋白酶。
实施例6
参照实施例3所述方法提取猕猴桃蛋白酶，区别仅在于，提取液按以下方式获得：将经粉碎的猕猴桃果与工艺水按料液比1:5混合，搅拌反应1.5h，即得提取液。
实施例7
参照实施例4所述方法提取无花果蛋白酶，区别仅在于，提取液按以下方式获得：将经粉碎的无花果青果与工艺水按料液比1:15混合，搅拌反应1.5h，即得提取液。
实验例1
检测实施例1～7所述蛋白酶的酶活以及酶活回收率，其具体检测方法和检测结果如下所示：
酶活检测方法：以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶的活性，检测方法参见“Su S N,Nie H L,Zhu L M et al.Optimization of adsorption conditions of papain on dye affinity membrane using response surface methodology[J].Bioresource technology,2009,100(8):2336-2340”。
酶活回收率测定方法：单位质量原料中植物蛋白酶酶活含量，以及从单位质量原料中提取的植物蛋白酶酶活含量，后者与前者的比值即为酶活回收率。
表1植物蛋白酶的酶活以及酶活回收率
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。