本发明属于蛋白质工程
技术领域：
，具体涉及S100B突变体及其应用。
背景技术：
：S100B是一种低分子量(7-11kDa)酸性钙结合蛋白，在人体中主要由星形胶质细胞合成。S100B属于S100家族成员，含有两个手型EF结构域，每个结构域都可以结合Ca2+，当与钙离子结合后，S100蛋白构象发生改变，暴露出其与靶蛋白的结合位点，进而通过与相应的靶蛋白作用发挥生物学效应。S100B蛋白作为一种钙传感器蛋白，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达及细胞凋亡中发挥重要作用。另外，S100B的异常表达往往能导致一些神经性、脑血管、肿瘤等疾病的发生，例如阿尔兹海默病，脑损伤，脑出血，黑色素瘤。人体中S100B的检测需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体。目前国内外针对S100B单克隆抗体的纯化主要是偶联S100B抗原的亲和层析柱、ProteinA柱、ProteinG柱等。ProteinA柱、ProteinG柱纯化收率和相对纯度较低，偶联S100B抗原的亲和层析柱纯化的单抗虽然特异性好，纯度相对较高，由于S100B抗原亲和柱与抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，收率较低。技术实现要素：针对现有技术存在的偶联S100B抗原的亲和层析柱纯化的单抗，由于S100B抗原亲和柱与抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，收率较低的上述问题，本发明提供一种S100B突变体，蛋白结构发生改变，从而降低了与S100B单克隆抗体的亲和力，利用这个特点，本发明还提供了制备了S100B单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，以sepharose4b为载体，偶联S100B突变体，可以快速、高效的得到高纯度S100B单克隆抗体。S100B含有两个EF手型结构域，每个结构域由两段螺旋和中间的一个连接环组成。在N端和C端螺旋上分布着大量疏水残基，两端都能结合Ca2+，C端的亲和力大于N端。当Ca2+与EF手型结构域结合时，蛋白构象发生变化，从而影响S100B与抗体的结合力。实验通过对S100B蛋白突变，经过大量筛选，确定了C端的K26R突变位点能引起S100B抗原与抗体亲和力的减弱，从而促成发明。本发明一方面提供了一种S100B突变体，其DNA序列如SEQIDNo:6所示，即：ATGTCTGAGCTGGAGAAGGCCATGGTGGCCCTCATCGACGTTTTCCACCAATATTCTGGAAGGGAGGGAGACAAGCACAGGCTGAAGAAATCCGAACTCAAGGAGCTCATCAACAATGAGCTTTCCCATTTCTTAGAGGAAATCAAAGAGCAGGAGGTTGTGGACAAAGTCATGGAAACACTGGACAATGATGGAGACGGCGAATGTGACTTCCAGGAATTCATGGCCTTTGTTGCCATGGTTACTACTGCCTGCCACGAGTTCTTTGAACATGAGTAA。。本发明还提供一种用于构建S100B突变体的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，即：GGGAGGGAGACAAGCACAGG，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNo:4所示，即：GTTCGGATTTCTTCAGCCTGTGCTT。本发明另一方面提供了一种S100B突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo:5所示，即：MSELEKAMVALIDVFHQYSGREGDKHRLKKSELKELINNELSHFLEEIKEQEVVDKVMETLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE。该突变体蛋白的突变位点为K26R。本发明还提供了上述S100B突变体蛋白在制备S100B抗体方面的应用。进一步的，所述S100B突变体蛋白作为抗原。本发明还提供了一种S100B抗体纯化使用的亲和层析柱，该层析柱以琼脂糖凝胶颗粒为载体，偶联S100B突变体蛋白。有益效果：本发明提供的S100B突变体蛋白构象的改变，略微降低了与抗体的亲和性。这种突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的S100B抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升。附图说明图1为S100B突变体蛋白纯度分析结果图。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。以下实施例中所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。实施例1S100B基因突变库的构建S100B抗原(购自上海友科生物科技有限公司，人工合成)的氨基酸序列如表SEQIDNo:1所示，即：MSELEKAMVALIDVFHQYSGREGDKHKLKKSELKELINNELSHFLEEIKEQEVVDKVMETLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE；其碱基序列如表SEQIDNo:2所示，即：ATGTCTGAGCTGGAGAAGGCCATGGTGGCCCTCATCGACGTTTTCCACCAATATTCTGGAAGGGAGGGAGACAAGCACAAGCTGAAGAAATCCGAACTCAAGGAGCTCATCAACAATGAGCTTTCCCATTTCTTAGAGGAAATCAAAGAGCAGGAGGTTGTGGACAAAGTCATGGAAACACTGGACAATGAT。为了解决S100B抗原(氨基酸序列如表SEQIDNo:1所示，核苷酸序列如表SEQIDNo:2所示)抗体的结合力，通过定向进化技术对该蛋白进行了大量突变的筛选，优化并自行设计其中的一对PCR引物：上游引物如序列表SEQIDNo:3所述，即：5’-GGGAGGGAGACAAGCACAGG-3’；下游引物如序列表SEQIDNo:4所述，即：5’-GTTCGGATTTCTTCAGCCTGTGCTT-3’。实施例2S100B突变体表达菌株的构建和发酵1、以S100B基因为模板，使用上述引物，加入2×TransStartFastPfuPCRSuperMix扩增整个质粒基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸5min，30个循环后，72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR结束后加入DMT酶消化体外降解非突变型质粒模板，胶回收目的基因。2、将胶回收突变体基因和pET-28a载体用BamHI和XhoI酶切后暴露出相同的末端，T4连接酶室温连接，转化DMT感受态细胞中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。次日，筛选得到重组菌株。3、从培养平板挑取单克隆菌落接种到10mlLB+Kan培养基中，37℃培养后，提取质粒，送测序公司检测。4、检测成功的质粒转化到BL21(DE3)感受态中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落接种到接种到5mlLB+Kan培养基中，37℃培养后接种到500mlLB+Kan培养基中，37℃扩大培养至OD600nm＝0.6-0.8，降温至16℃，加入0.5mMIPTG诱导过夜。S100B突变体蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo:5所示，S100B突变体蛋白的突变位点为K26R，即：MSELEKAMVALIDVFHQYSGREGDKHRLKKSELKELINNELSHFLEEIKEQEVVDKVMETLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE。该S100B突变体蛋白的编码基因序列如序列表SEQIDNo:6所示，即：ATGTCTGAGCTGGAGAAGGCCATGGTGGCCCTCATCGACGTTTTCCACCAATATTCTGGAAGGGAGGGAGACAAGCACAGGCTGAAGAAATCCGAACTCAAGGAGCTCATCAACAATGAGCTTTCCCATTTCTTAGAGGAAATCAAAGAGCAGGAGGTTGTGGACAAAGTCATGGAAACACTGGACAATGATGGAGACGGCGAATGTGACTTCCAGGAATTCATGGCCTTTGTTGCCATGGTTACTACTGCCTGCCACGAGTTCTTTGAACATGAGTAA实施例3S100B突变体纯化缓冲液A:50mMPBS,500mMNaCl缓冲液B:50mMPBS,500mMNaCl,500mMimidazole1、诱导表达后的菌液8000rpm离心5min，缓冲液A重悬菌体，超声破碎30min后12000rpm离心30min收集上清液。2、将上清液加入到Ni-NTA中结合1h，使用缓冲液A和缓冲液B配制咪唑浓度为10mM，20mM，50mM，200mM缓冲液分步洗脱目的蛋白。3、启动蠕动泵，流速30rpm，同时打开蛋白检测仪，用各种梯度的缓冲液冲至检测仪基线至平稳。4、收集各种梯度洗脱的蛋白样品，并取少量样品制备SDS-PAGE所需要的样品。5、收集目的蛋白并浓缩换液，测定蛋白浓度。实施例4S100B突变体亲和柱偶联工艺及使用方法1、偶联1.1、活化sepharose4b树脂称取1.00g的sepharose4b树脂于烧杯中，加入50mL的1mM盐酸室温下溶胀5min，转入抽滤瓶抽滤后，直接加50mL的1mM盐酸，室温浸没5min后再抽滤，反复共5次；(少量多次)加入15-20mL的1mM盐酸将树脂吸取转入小三角瓶准备偶联。1.2、突变体蛋白准备将S100B突变体蛋白换液至100mMNaHCO3,pH8.3,500mMNaCl中,浓度10mg/mL。1.3、偶联突变体上述步骤1.1中小三角瓶中让树脂自然沉降后吸取上清，再将瓶子倾斜后用200μL枪吸取上清；加入前处理过的突变体，补加1mL的NaHCO3缓冲液，25℃下50rpm摇床上振荡1-2h。1.4、测定蛋白浓度偶联体转入离心管中8000rpm4℃下离心10min后取上清，计量体积和检测蛋白含量。计算偶联率。1.5、抗原偶联体清洗处理用50mL的0.1M碳酸氢钠(pH8.3，含0.5M的氯化钠)冲洗偶联体于抽滤瓶中；抽滤后，再用碳酸氢钠50mL冲洗一遍；抽滤后，加入0.1M的pH8的Tris-HCl缓冲液100mL，将抽滤瓶下端用保鲜膜堵好，使其室温下浸泡封闭2h。封闭之后用抽滤掉封闭液，用0.1M的pH4的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.1M的pH8的Tris-HCl(含0.5M的氯化钠)缓冲液各50mL轮换冲洗，再抽滤，反复四次。最后加入50mL的0.02M的pH8.0的PBS洗涤、抽滤，反复3次。1.6、装柱用10mL0.02M的PBS混匀，取出来装柱；自然沉淀后，拧紧柱子；进0.02M的pH7.4的PBS冲洗，检查是否遗漏。装柱前可以取0.1mL偶联体重悬液，进行BCA测定，沉淀中显示较深的蓝色，说明抗原在偶联和封闭、冲洗时均为正常偶联。实施例5S100B抗体纯化方法的比较人S100B蛋白刺激小鼠，杂交瘤细胞，收集腹水，纯化抗体等步骤，制备得到S100B单克隆抗体，根据S100B抗体的特点，从抗体纯度、回收率、稳定性等为出发点，设计并验证了三套实验方法，并对纯化方案做了相关比较。方法(1)：proteinG亲和层析柱纯化S100B抗体方法(2)：S100B抗原亲和层析柱纯化S100B抗体方法(3)：S100B抗原突变体亲和层析柱纯化S100B抗体1.1平衡：用20mL纯水清洗proteinG层析柱、S100B抗原亲和柱、S100B抗原突变体亲和柱，再用20mL结合缓冲液(0.02MPBS，pH8.0)以1mL/min的速度冲洗三种层析柱。1.2上样：样品用结合缓冲液稀释5倍，用0.22um除菌器除菌。用注射器上样，收集穿透液。1.3洗脱：用结合缓冲液冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，弃流出液。用洗脱缓冲液(0.1Mglycine-HCl，pH＝2.8)冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，并收集流出液(即洗脱液)。目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE和Western-Blot，Bandscan扫描分析抗体纯度。一、单克隆抗体亲和常数测定亲和常数表示抗体与抗原结合的紧密程度，是确定抗体性质的重要参数之一，同时也是单克隆抗体稳定性的重要指标。三种方法洗脱的目的蛋白经过SDS-PAGE和Western-Blot验证后进行浓度测定。二、非竞争ELISA测定mAb的相对亲和常数实验步骤如下：①分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL三种浓度的人源S100B蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；②洗板，PBST200μL/孔，洗涤3次，5min/次；③封闭：用3％的BSA作为封闭液，110μL/孔，37℃保温孵育2h；④洗板：同②；⑤一抗：加入梯度稀释的单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温孵育2h；⑥洗板：同②；⑦二抗：1：3000稀释酶标二抗，100μL/孔，37℃保温孵育45min；⑧洗板：同②；⑨显色：加入底物使用液，100μL/孔，37℃保温避光显色10min；⑩终止：每孔加入50μL终止液，450nm处测Abs值。三、单克隆抗体稳定性实验同样采用间接ELISA测定冻存前和冻存3个月后抗体与抗原的结合力，测定OD450nm处吸光值之差，比较三者的差别。分析结果：(1)S100B抗原突变体的纯度分析，如图1所示，经过Bandscan扫描分析软件，S100B抗原突变体纯度大于95％。(2)三种抗体纯化方法的比较：表1三种抗体纯化方法的比较方法纯度回收率单抗亲和常数单抗稳定性(Abs)proteinG亲和层析纯化48.6％70％-75％1.24×108L/mol0.407S100B抗原亲和层析纯化95％28％8.11×108L/mol0.513S100B抗原突变体亲和层析纯化95％75％-85％7.43×108L/mol0.421表1说明三种纯化方法均能获得有活性的S100B抗体，其中，proteinG亲和层析纯化的抗体纯度和活性偏低；S100B抗原亲和层析纯化的抗体回收率低；S100B抗原突变体亲和层析纯化活性和回收率都高。序列表<110>青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司<120>S100B突变体及其应用<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>92<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1MetSerGluLeuGluLysAlaMetValAlaLeuIleAspValPheHis151015GlnTyrSerGlyArgGluGlyAspLysHisLysLeuLysLysSerGlu202530LeuLysGluLeuIleAsnAsnGluLeuSerHisPheLeuGluGluIle354045LysGluGlnGluValValAspLysValMetGluThrLeuAspAsnAsp505560GlyAspGlyGluCysAspPheGlnGluPheMetAlaPheValAlaMet65707580ValThrThrAlaCysHisGluPhePheGluHisGlu8590<210>2<211>192<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2atgtctgagctggagaaggccatggtggccctcatcgacgttttccaccaatattctgga60agggagggagacaagcacaagctgaagaaatccgaactcaaggagctcatcaacaatgag120ctttcccatttcttagaggaaatcaaagagcaggaggttgtggacaaagtcatggaaaca180ctggacaatgat192<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3gggagggagacaagcacagg20<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4gttcggatttcttcagcctgtgctt25<210>5<211>92<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5MetSerGluLeuGluLysAlaMetValAlaLeuIleAspValPheHis151015GlnTyrSerGlyArgGluGlyAspLysHisArgLeuLysLysSerGlu202530LeuLysGluLeuIleAsnAsnGluLeuSerHisPheLeuGluGluIle354045LysGluGlnGluValValAspLysValMetGluThrLeuAspAsnAsp505560GlyAspGlyGluCysAspPheGlnGluPheMetAlaPheValAlaMet65707580ValThrThrAlaCysHisGluPhePheGluHisGlu8590<210>6<211>279<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6atgtctgagctggagaaggccatggtggccctcatcgacgttttccaccaatattctgga60agggagggagacaagcacaggctgaagaaatccgaactcaaggagctcatcaacaatgag120ctttcccatttcttagaggaaatcaaagagcaggaggttgtggacaaagtcatggaaaca180ctggacaatgatggagacggcgaatgtgacttccaggaattcatggcctttgttgccatg240gttactactgcctgccacgagttctttgaacatgagtaa279当前第1页1 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