本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种编码特异性抗肿瘤的fc融合蛋白pd1/fgfr1及其核苷酸序列、重组表达载体、表达细胞和应用，还涉及一种包括fc融合蛋白pd1/fgfr1的抗肿瘤药物。
背景技术：
：程序性细胞死亡蛋白1(programmedcelldeathprotein1，pd1)，是一种免疫球蛋白超家族i型跨膜糖蛋白，属于t细胞共抑制受体。它可被诱导性地表达在活化的t细胞、b细胞、nk细胞、单核细胞和树突状细胞表面，与其配体pdl1、pdl2(该配体主要表达于肿瘤微环境中，长时间地暴露于抗原并介导t细胞抑制作用)相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制肿瘤微环境中免疫细胞的免疫应答反应。新近研究表明，针对pd1的免疫治疗对多种肿瘤有效，通过阻断pd1与pdl1/2信号通路能够有效清除肿瘤微环境的免疫抑制作用，显著提高t细胞的抗肿瘤免疫活性，这是因为一旦肿瘤细胞被pd1抗体攻击后，免疫细胞就可以各显神通并根据作战方案各个击破肿瘤细胞。针对pd1/pdl1、pdl2通路的免疫治疗甚至是对其他治疗无效的患者仍诱导出非常持久的免疫应答，是迄今为止所有类型肿瘤中最成功的免疫治疗策略。目前，pd1的免疫治疗费用昂贵，对于肿瘤治疗的免疫治疗又普遍存在效率不高的问题，因而对于临床进一步推广存在限制。技术实现要素：为了进一步提高pd1的抗肿瘤作用，本发明提供了一种特异性抗肿瘤fc融合蛋白pd1/fgfr1，该融合蛋白对肿瘤细胞和肿瘤新生血管具有特异性靶向，能够明显抑制肿瘤生长。本发明的目的还在于提供一种包括fc融合蛋白pd1/fgfr1的特异性抗肿瘤药物。为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种fc融合蛋白pd1/fgfr1，由pd1、fgfr1和鼠源抗体段的编码基因编码得到。优选的，所述pd1、fgfr1和鼠源抗体fc段编码基因的顺序由5’端到3’端依次为pd1-fgfr1-fc。优选的，所述pd1的编码基因选自seqidno:2所示核苷酸序列或与seqidno:2所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列；所述fgfr1的编码基因选自seqidno:3所示核苷酸序列或与seqidno:3所示核苷酸序列具有99％同源性的核苷酸序列；所示鼠源抗体fc段的编码基因选自seqidno:4所示核苷酸序列或与seqidno:4所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。优选的，所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列如seqidno:1所示。优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列选自seqidno:7所示氨基酸序列或与seqidno:7所示氨基酸序列具有99％同源性的氨基酸序列。本发明提供了一种核酸分子，为编码上述技术方案所述fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列。本发明提供了一种重组表达载体，包括上述技术方案所述的核酸分子。本发明提供了一种表达细胞，含有上述技术方案所述的重组表达载体。本发明前述技术方案所述的fc融合蛋白pd1/fgfr1、核酸分子、重组表达载体或表达细胞在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种特异性抗肿瘤药物，包括前述技术方案所述的fc融合蛋白pd1/fgfr1和药学上可接受的辅料。与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供了一种由pd1、fgfr1和鼠源抗体fc段的编码基因编码得到fc融合蛋白pd1/fgfr1。本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1具有显著的肿瘤血管靶向作用，使得有效物质在肿瘤组织和或肿瘤新生血管中高浓度的富集，本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1中含有的pd1蛋白，与肿瘤微环境中的pdl1结合，通过竞争性结合来降低t细胞表面的pd1与肿瘤细胞表面配体pdl1、pdl2的结合进而阻断pd1信号通路的持续激活，从而充分发挥清除免疫抑制作用，提供高效的肿瘤免疫治疗作用。同时，本发明所述的fc融合蛋白pd1/fgfr1中包括鼠源抗体fc段，鼠源抗体fc段不仅能够延长融合蛋白的体内半衰期，从而延长作用时间，其还具有增强抗原提呈细胞对把抗原的提呈能力，鼠源抗体fc段与fgfr1/pd1结合能够显著增强抗原提呈能力，进而增加本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1对肿瘤细胞的杀伤能力。本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1巧妙借助fgfr1的肿瘤血管特异性靶向作用、鼠源fc段延长体内半衰期和增强抗原提呈能力的作用，使得pd1能够更为精准的靶向肿瘤组织进而诱导出更为强力和持久的抗肿瘤作用。研究表明，本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1具有较高的肿瘤血管靶向特性，并能够显著抑制乳腺癌等肿瘤的生长、缩小肿瘤体积，抑瘤率可达到70％以上。附图说明图1为本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1的重组表达载体结构示意图；图2为实施例1步骤3)pcr扩增产物的电泳图，其中，m为dna标准分子量，1～3均为步骤3)中得到的扩增产物；图3为实施例1步骤7)pcr鉴定的电泳图，其中，m为dna标准分子量，1～5为随机挑选的转化菌扩增产物；图4为实施例2中fc融合蛋白pd1/fgfr1电泳分离鉴定的电泳图，其中，m为蛋白标准分子量，泳道1为1μgfc融合蛋白pd1/fgfr1的变性电泳图，泳道2为1μgfc融合蛋白pd1/fgfr1的非变性电泳图；图5为实施例3中免疫荧光染色图，其中，a为试验组小鼠的肿瘤组织免疫荧光染色图，b为对照组小鼠的肿瘤组织荧光免疫染色图；图6为实施例4中各组小鼠的给药时间和肿瘤体积的曲线图；图7为融合蛋白药物对小鼠乳腺癌4t1肿瘤瘤重的影响柱状图；**表示相对于生理盐水对照组存在极显著差异。具体实施方式本发明提供了一种由pd1、fgfr1和鼠源抗体fc段的编码基因编码得到的fc融合蛋白pd1/fgfr1。所述fc融合蛋白pd1/fgfr1的分子量在83kda，具有肿瘤血管靶向特异性以及显著的抗肿瘤作用。在本发明中，所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列中，编码基因的顺序优选为：从5’端到3’端依次为pd1-fgfr1-fc。在本发明中，所述pd1的编码基因为任何能够编码pd1蛋白的核苷酸序列，优选的选自seqidno:2所示核苷酸序列或与seqidno:2所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列，在本发明的一些具体实施方式中pd1的编码基因更优选为seqidno:2所示的核苷酸序列。所述与seqidno:2所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的pd1编码序列中获得，在此不再赘述。所述seqidno:2所示的核苷酸序列如下：gaggtccccaatgggccctggaggtccctcaccttctacccagcctggctcacagtgtcagagggagcaaatgccaccttcacctgcagcttgtccaactggtcggaggatcttatgctgaactggaaccgcctgagtcccagcaaccagactgaaaaacaggccgccttctgtaatggtttgagccaacccgtccaggatgcccgcttccagatcatacagctgcccaacaggcatgacttccacatgaacatccttgacacacggcgcaatgacagtggcatctacctctgtggggccatctccctgcaccccaaggcaaaaatcgaggagagccctggagcagagctcgtggtaacagagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcgcccaaaccagaaggccggtttcaaggcatg。程序性细胞死亡蛋白1(pd1)属于t细胞共抑制受体，其与配体pdl1、pdl2相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用。肿瘤细胞中会高表达pd1蛋白的配体pdl1和pdl2，肿瘤细胞产生的pdl1和pdl2能够特异性的与微环境中pd1结合，使得pd1通路持续激活，进而t细胞功能被抑制，无法通过免疫作用正常杀伤肿瘤细胞。本发明所述核苷酸序列编码的融合蛋白含有pd1蛋白，与肿瘤微环境中pdl1或pdl2结合，通过竞争性结合来降低t细胞表面pd1与肿瘤细胞表面配体pdl1和pdl2的结合，进而阻断pd1信号通路的持续激活，达到清除免疫抑制的作用，激活正常的机体免疫系统杀伤肿瘤细胞。在本发明中，所述fgfr1的编码基因为任何能够编码fgfr1蛋白的核苷酸序列，优选的选自seqidno:3所示核苷酸序列或与seqidno:3所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。在本发明的一些实施例中，fgfr1的编码基因更优选为seqidno:3所示的核苷酸序列。所述与seqidno:3所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的fgfr1编码序列中获得，在此不再赘述。所述seqidno:3所示的核苷酸序列如下：ggtggaggttcgggtggaggttcaggtggaggttctaggccagccccaaccttgcctgaacaagctcagccctggggagtccctgtggaagtggagtctctcctggtccaccctggcgacctgctacagcttcgctgtcggcttcgcgatgatgtgcagagcatcaactggctgcgggatggggtgcagctggtggagagcaaccgtacccgcatcacaggggaggaggtggaggtgcgggactccatccccgctgactctggcctctacgcttgcgtgaccagcagcccctctggcagcgataccacctacttctccgtcaatgtctcagatgcactcccatcctcggaagatgatgacgacgacgatgactcctcctcggaggagaaagagacggacaacaccaaaccaaaccgtaggcctgtagctccctactggacatccccagagaaaatggagaagaaactgcatgcggtgcccgctgccaagacggtgaagttcaagtgcccgtcgagtgggacacccaaccccactctgcgctggttgaaaaatggcaaagagtttaagcctgaccaccgaattggaggctacaaggttcgctatgccacctggagcatcataatggattctgtggtgccttctgacaagggcaactacacctgcatcgtggagaatgagtatgggagcatcaaccacacctaccagcttgacgtcgtggaacgatctccgcaccgacccatccttcaggcagggctgcctgccaacaagacagtggccctgggcagcaatgtggagttcatgtgtaaggtgtacagcgatccgcagcctcacattcagtggctgaagcacatcgaggtgaacgggagtaagatcgggccagacaacttgccgtatgtccagatcctgaagactgctggagttaataccaccgacaaggaaatggaggtgcttcatctacggaatgtctcctttgaggatgcgggggagtatacgtgcttggcgggtaactctatcggactctcccatcactctgcatggttgaccgttctggaagccctggaagagagaccagctgtgatgacctcaccgctctacctgga。碱性成纤维细胞生长因子受体1(fgfr1)是通过与高亲和力配体bfgf结合而发挥生物学活性，促进肿瘤新生血管生成，本发明基于以下原因选择fgfr1组成融合蛋白：(1)特异性和天然靶向性，fgfr1在肿瘤新生血管的内皮细胞中高效表达，而在正常的细胞及血管内皮细胞中并无表达，其对肿瘤细胞的特异性极强；(2)遗传稳定性，血管内皮细胞遗传稳定，突变率低，故针对肿瘤血管内皮细胞的治疗策略不会或只会引起微乎其微的抗药性。所以，选择fgfr1与pd1、鼠源抗体fc段组成fc融合蛋白pd1/fgfr1能够提供精准的靶向作用，使得抗肿瘤活性成分集中在肿瘤细胞和或肿瘤新生血管以充分发挥抗肿瘤功效。本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1含有fgfr1蛋白，进入体内后能够特异性地与肿瘤细胞中高表达的bfgf结合，实现将fc融合蛋白pd1/fgfr1特异性靶向肿瘤细胞和或肿瘤新生血管的目的。同时，本发明所述的fc融合蛋白pd1/fgfr1中fgfr1与肿瘤细胞内的配体bfgf结合后还能够干扰bfgf/fgfr1信号通路进而抑制肿瘤新生血管生成，达到抑制肿瘤继续生长作用。在本发明中，所述鼠源抗体fc段的编码基因为任何能够编码得到鼠源抗体fc段的核苷酸序列，优选的选自seqidno:4所示核苷酸序列或与seqidno:4所示核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列。在本发明的一些实施例中鼠源抗体fc段的编码基因优选为seqidno:4所示的核苷酸序列。所述与seqidno:4所述核苷酸序列具有99％以上同源性的核苷酸序列可以从本领域已知的鼠源抗体fc段的编码序列中获得，在此不再赘述。所述seqidno:4所示的核苷酸序列如下：cagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatga。fc融合蛋白是融合蛋白分子与抗体fc段融合所产生的融合蛋白，不但能够保留原功能蛋白的全部生物活性还能够延长体内半衰期，并且完全取代抗体功能而免疫原性极低。本发明利用鼠源的抗体fc段除了上述优势外，还能够增强抗原提呈细胞对靶抗原的提呈能力。本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1通过pd1在体内与肿瘤细胞表面的pd1配体竞争性结合，从而阻断pd1通路来实现清除免疫抑制的目的。鼠源抗体fc段增强提呈能力的作用则能够进一步增强机体免疫杀伤作用，协同pd1增强抗肿瘤效果，进而使得本发明所述fc融合蛋白pd1/fgfr1具有显著的肿瘤细胞杀伤作用。本发明将具有肿瘤靶向(fgfr1)、抗肿瘤血管生成(fgfr1)、清除免疫抑制作用(pd1)以及增强抗原提呈作用(鼠源抗体fc段)综合在一起构建核苷酸序列，从而编码得到一种具有特异性抗肿瘤作用的fc融合蛋白pd1/fgfr1，fc融合蛋白pd1/fgfr1中各部分相互促进，从而协同发挥抗肿瘤作用，达到抑制肿瘤生长、延长癌症患者生存时间的效果。现有研究主要采用直接将pd1抗体注入体内的方式阻断pd1/pdl1、pdl2通路，然而这种方式一方面在pd1抗体进入机体后会存在部分损失；另一方面pd1抗体进入机体后也难以直达肿瘤组织造成，其分布难以有效控制，从而在肿瘤组织中也难以形成有效的治疗剂量。本发明提供的融合蛋白采用fc融合蛋白pd1/fgfr1优选的可以进行局部瘤内给药，直接在肿瘤细胞位点处靶向获得高浓度的pd1，解决常规pd1抗体直接给药存在的活性损失以及难以在肿瘤组织部分获得有效浓度的问题。在本发明中，所述fc融合蛋白pd1/fgfr1的氨基酸序列选自seqidno:7所示氨基酸序列或与seqidno:7所示氨基酸序列具有99％同源性的氨基酸序列。所述seqidno:7所示的氨基酸序列如下：evpngpwrsltfypawltvseganatftcslsnwsedlmlnwnrlspsnqtekqaafcnglsqpvqdarfqiiqlpnrhdfhmnildtrrndsgiylcgaislhpkakieespgaelvvteriletstrypspspkpegrfqgmgggsgggsgggsrpaptlpeqaqpwgvpvevesllvhpgdllqlrcrlrddvqsinwlrdgvqlvesnrtritgeevevrdsipadsglyacvtsspsgsdttyfsvnvsdalpssedddddddssseeketdntkpnrrpvapywtspekmekklhavpaaktvkfkcpssgtpnptlrwlkngkefkpdhriggykvryatwsiimdsvvpsdkgnytciveneygsinhtyqldvversphrpilqaglpanktvalgsnvefmckvysdpqphiqwlkhievngskigpdnlpyvqilktagvnttdkemevlhlrnvsfedageytclagnsiglshhsawltvlealeerpavmtsplyledprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpg本发明提供了一种编码上述技术方案所述fc融合蛋白pd1/fgfr1的核酸分子。所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列优选的如seqidno:1所示。本发明提供了一种含有前述技术方案所述核酸分子的重组表达载体，用于表达fc融合蛋白pd1/fgfr1。本发明所述重组表达载体优选为哺乳动物表达载体，在哺乳动物中表达有利于保持fc融合蛋白pd1/fgfr1的生物活性。本发明所述重组表达载体的图谱优选的如图1所示。本发明提供了一种含有上述技术方案所述重组表达载体的表达细胞，用于表达fc融合蛋白pd1/fgfr1。本发明优选的以hek293细胞作为所述重组表达载体的表达细胞。在本发明中，所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列、fc融合蛋白pd1/fgfr1、重组表达载体制备和构建均采用本领域常用方法即可，本发明无特殊限定。本发明还提供了所述fc融合蛋白pd1/fgfr1在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了所述含有所述编码fc融合蛋白pd1/fgfr1的核苷酸序列的重组表达载体在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了所述含有fc融合蛋白pd1/fgfr1的重组表达载体的表达细胞在制备特异性抗肿瘤药物中的应用。本发明优选的，上述应用中所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌和肾细胞癌等。本发明还提供了一种特异性抗肿瘤药物，包括所述fc融合蛋白pd1/fgfr1和药学上可接受的辅料。优选的，在所述特异性抗肿瘤药物中，fc融合蛋白pd1/fgfr1含量为1～99％，更优选为50～99％。在本发明中，所述特异性抗肿瘤药物优选的为抗肿瘤疫苗，该抗肿瘤疫苗通过瘤内注射使体内局部肿瘤组织富集高浓度pd1，进而发挥有效的免疫清除作用。进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物中还包括药用辅料；所述药用辅料包括但不限于药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。其中，药用载体包括但不限于脂质体、醇质体、聚合物胶束、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米载体、介孔二氧化硅纳米粒等；所述稀释剂、佐剂和赋形剂等药物辅料具体的可以包括药用防腐剂、抗氧化剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂或等渗和吸收延缓剂等。进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂；具体的，所述片剂包括但不限于糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含片等；所述溶液剂包括但不限于注射剂、口服液；所述胶囊剂包括但不限于硬胶囊剂、软胶囊剂等。具体的，当本发明需要将抗肿瘤药物制成特定剂型时，按照剂型选择适宜的药用辅料。进一步的，本发明所述特异性抗肿瘤药物的给药途径包括但不限于注射给药、口服给药、直肠给药等。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1构建重组质粒1)按照文献《小鼠可溶性pd1的克隆、真核表达及生物学活性检测》记载的方法制备pd1/fc-pcdna3.1质粒(覃晓琳,刘朝奇,唐国慧,等.小鼠可溶性pd1的克隆、真核表达及生物学活性检测[j].生物技术通报,2011(2):121-125.)。所述制备得到的pd1/fc-pcdna3.1质粒中含有如seqidno:2所示的pd1编码基因。2)按照文献《小鼠fgfr1/mip3a-fc融合基因真核表达载体的构建及表达》的记载，制备mip3a/fgfr1-fc质粒(黄用豪,和永壮,张晓钿,等.小鼠fgfr1/mip3a-fc融合基因真核表达载体的构建及表达[j].中国热带医学,2017,17(4):340-343.)，制备得到的mip3a/fgfr1-fc质粒中含有如seqidno:3所示的fgfr1编码序列和如seqidno:4所示的鼠源抗体fc段编码序列。3)以步骤2)制备得到的mip3a/fgfr1-fc质粒为模板，利用上下游引物进行pcr扩增得到扩增产物，对扩增产物进行电泳，结果如图2所示，pcr扩增得到大小约为1146bp的特异性片段，与理论值相符，即得含有目的片段linker-fgfr1-fc的扩增产物。其中，上游引物的核苷酸序列如seqidno:5所示，即：aaggccggtttcaaggcatgggtggaggttcgggtggaggttcaggtggaggttctag；下游引物的核苷酸序列如seqidno:6所示，即：gcttgattgtgggccctctgggatcctccaggtagagcggtgaggt。所述pcr扩增体系为50μl体系，含有：ddh2o41μl、10pcrbuffer5μl、dntp(2.5mmeach)1μl、上下游引物(20mm)各0.5μl、pfu高保真dna聚合酶(2.5u/l)1μl、模板(20ng)1μl。所述pcr反应条件为：95℃预变性5min→94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次→72℃充分延伸5min。4)用1.8％的琼脂糖凝胶对步骤3)得到的扩增产物进行电泳分离，在紫外透射仪中用手术刀切下分离有目的片段linker-fgfr1-fc的琼脂糖凝胶，对其用axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段(详细步骤见相关说明书)。5)以步骤1)制备得到的pd1/fc-pcdna3.1质粒为载体，载体用限制性内切酶bamhi酶切线性；取步骤4)纯化的目的片段(50ng)3μl、酶切后的载体(50ng)3μl、gibsonmix10μl和ddh2o4μl混合，50℃下水浴15min，得到重组反应液。6)取重组反应液5μl加至50μldh5a的感受态细胞中，混匀，冰浴30min；42℃水浴90s，再冰浴2min；加600μllb，37℃1h后，取100μl涂布于含100μg/mlamp的lb平皿，37℃培养过夜，得到转化菌。7)重组质粒pcr鉴定：在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行pcr鉴定。pcr反应体系共25μl，含有：ddh2o18.75μl、10pcrbuffer2.5μl、10mmoldntps0.5μl、步骤3)所述上下游引物各0.5μl、taqdnapolymerase(12u/l)0.25μl和转化菌2μl。以上体系先94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min。所得产物以1.2％琼脂糖电泳检测。电泳检测结果如图3所示，5个克隆中有4个克隆为阳性克隆。第1～3以及5泳道扩增得到了大小约为1146bp的特异性dna分子片段，与fgfr1基因片段大小一致，表明在这些克隆中fgfr1基因片段成功插入到了载体质粒中。8)将步骤7)中鉴定的阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，经测序比对与预期序列完全一致。阳性克隆中的重组质粒含有如seqidno:1所示的核苷酸序列。实施例2fc融合蛋白pd1/fgfr1的表达和纯化(1)fc融合蛋白pd1/fgfr1在hek293细胞中瞬时表达将处于对数生长期的hek293细胞用胰酶消化后稀释至6×105/ml的密度，接种到15cm培养皿中，每个培养皿加20ml无血清培养基，培养24小时进行转染。利用lipofectamine2000转染试剂(invitrogen公司)将实施例1得到的重组质粒转染至hek293细胞，所用质粒由无内毒素质粒抽提试剂盒提取(sigma公司)。转染的细胞在5％的二氧化碳培养箱中培养5天后，得到上清液。用酶联免疫吸附法(elisa)测定上清中的融合蛋白产量，表达浓度为3.3mg/l。(2)fc融合蛋白pd1/fgfr1的纯化将收集的培养上清用proteina亲合层析柱(购自ge公司)纯化。用1xpbs(ph＝7.4)清洗和平衡纯化柱，上样速度2ml/min，过15倍柱体积。调节上样流速至1ml/min进行上样。上样结束后，用1xpbs(ph＝7.4)清洗纯化柱，上样速度2ml/min，过15倍柱体积。进液端换上甘氨酸溶液(ph＝2.5)，调节流速至1ml/min洗脱融合蛋白。向收集管中加入tris8.0缓冲液将蛋白调至ph值中性。最后融合蛋白透析至1xpbs(ph＝7.4)中。纯化好的fc融合蛋白pd1/fgfr1经sds-page检测。sds-page检测结果如图4所示，泳道1为fgfr1-pd1/fc融合蛋白的变性电泳图，融合蛋白的分子量为130kda；泳道2为fc融合蛋白pd1/fgfr1的非变性电泳图，融合蛋白的分子量为83kda。可以看出纯化的蛋白质在位于83kda左右处出现相对单一的条带，说明纯化收集到的蛋白质为重组目的蛋白。对比例11)按照文献《小鼠可溶性pd1的克隆、真核表达及生物学活性检测》记载的方法制备pd1/fc-pcdna3.1质粒(覃晓琳,刘朝奇,唐国慧,等.小鼠可溶性pd1的克隆、真核表达及生物学活性检测[j].生物技术通报,2011(2):121-125)。所述制备得到的pd1/fc-pcdna3.1质粒中含有如seqidno:2所示的pd1编码基因。2)按照实施例2所述方法将pd1/fc-pcdna3.1质粒转入hek293细胞中表达并纯化，得到pd1/fc融合蛋白。对比例21)按照gibson克隆的方法将fgfr1蛋白的编码序列、鼠源抗体fc段的编码基因克隆入pcdna3.1(+)质粒(购买于invitrogen)，制备fgfr1/fc重组表达载体；其中fgfr1蛋白的编码序列如seqidno:3所示，鼠源抗体fc段的编码基因序列如seqidno:4所示；2)按照实施例2所述方法将步骤1)得到的fgfr1/fc重组表达载体转入hek293细胞中表达并纯化，得到fgfr1/fc融合蛋白。实施例3fc融合蛋白pd1/fgfr1的肿瘤特异性靶向作用1模型的制备购买小鼠乳腺癌细胞株4t1并进行培养，将培养的小鼠乳腺癌细胞4t1的细胞液浓度调整至1×107个/ml，以每只0.1ml接种于小鼠右侧腋窝皮下。2分组与给药将接种的小鼠随机分为试验组和对照组，每组8只，待肿瘤长至体积约110mm3时经瘤内按照500μg/kg小鼠体重的比例进行注射，其中试验组注射实施例2制备得到的fc融合蛋白pd1/fgfr1、对照组注射对比例1制备得到的融合蛋白pd1/fc。各组给药后30天后处死小鼠，取出肿瘤组织进行冰冻切片并进行免疫荧光染色观察。结果如图5所示，a为试验组小鼠的肿瘤切片染色图，可以看到肿瘤微血管表面见绿色荧光信号沉积，而其他组织成分中没有明显的荧光信号；b为对照组的小鼠切片染色图，而对照组肿瘤微血管表面未见绿色荧光信号沉积。这表明本发明制备的fc融合蛋白pd1/fgfr1具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性，可以有效地在肿瘤组织和肿瘤新生血管富集，还可以减少药物用量。实施例41、模型的制备购买小鼠乳腺癌细胞株4t1并进行培养，将培养的小鼠乳腺癌细胞4t1的细胞液浓度调整至1×107个/ml，以每只0.1ml接种于小鼠右侧腋窝皮下。2、分组与给药待肿瘤长至100～150mm3时将动物随机分为5组，每组8只。具体分组为：(1)pd1/fgfr1/fc组：按照500μg/kg小鼠体重，将实施例2制备得到的fc融合蛋白pd1/fgfr1与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，三天给药一次；(2)pd1/fc组：按照500μg/kg小鼠体重，将对比例1制备得到的pd1/fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，三天给药一次；(3)fgfr1/fc组：按照500μg/kg小鼠体重，将对比例2制备得到的fgfr1/fc融合蛋白与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，三天给药一次；(4)佐剂生理盐水组：等体积生理盐水与与佐剂(首次使用弗氏完全佐剂，其余均用弗氏不完全佐剂)1：1乳化后对小鼠进行瘤内注射，三天给药一次；(5)生理盐水组：将与第(1)组相同体积的生理盐水经瘤内注射，三天给药一次。使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。观察动物给药过程和给药后的变化(活动，外观，精神)，连给药30天后，随即处死小鼠，手术剥取瘤块称重。具体的融合蛋白与佐剂配制方法如下：本次实验中药物给药剂量为500ug/kg，融合蛋白浓度即为0.1mg/ml，给药体积为100ul/20g小鼠体重。配制时先用生理盐水稀释蛋白到0.2mg/ml的浓度，按与佐剂体积比例1:1来研磨，所得浓度为0.1mg/ml，按照100ul/20g瘤内注射。生理盐水佐剂组用1:1的生理盐水和佐剂研磨乳化，按照100ul/20g瘤内注射。其中佐剂与融合蛋白溶液的乳化方法为：取一定体积的佐剂放入无菌的玻璃研钵内，再缓缓滴入等体积的融合蛋白溶液，边滴边按同一方向研磨。待蛋白全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本次试验中采用的弗氏完全佐剂购自sigma公司，货号f5881；采用的弗氏不完全佐剂购自sigma公司，货号f5506。使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。观察动物给药过程和给药后的变化(活动，外观，精神)，连给药30天后，随即处死小鼠，手术剥取瘤块称重。3、观测指标1)肿瘤体积(tumorvolume,tv)的计算公式为：tv＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长宽。2)根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)，计算公式为：rtv＝vt/v0其中v0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，vt为每一次测量时的肿瘤体积。3)抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率t/c(％)，计算公式如下：trtv：治疗组rtv(相对肿瘤体积)；crtv：模型组(生理盐水组)rtv(相对肿瘤体积)；4)抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：4、观测结果：(1)pd1/fgfr1/fc对肿瘤体积的影响表1各组连续给药30d中的肿瘤体积变化(cm3)组别生理盐水组佐剂生理盐水组fgfr1/fc组pd1/fc组pd1/fgfr1/fc组1d0.1120.1090.1120.1110.1124d0.2040.1910.1810.1740.1667d0.3270.3190.2650.2540.23010d0.5230.4790.3790.3600.33713d0.7710.7470.4980.4940.41316d1.0350.9660.5940.5710.47519d1.3051.1890.6650.6460.54122d1.5841.4670.7420.7130.58725d1.8251.7010.7910.7390.63528d2.1921.9690.8710.7860.67731d2.5502.3480.9370.8450.730各组小鼠连续给药30d观测到的肿瘤体积变化图如图6所示，具体结果如表1所示。如图6和表1的数据所示，pd1/fgfr1/fc组、fgfr1/fc组、pd1/fc组与生理盐水组或佐剂生理盐水组相比，肿瘤体积均有显著降低，并且随着给药的延长肿瘤体积不会显著增加，即fc融合蛋白pd1/fgfr1、fgfr1/fc融合蛋白和pd1/fc融合蛋白均具有一定的抑制肿瘤生长的作用。还可以看出，pd1/fgfr1/fc组与fgfr1/fc组、pd1/fc组相比，肿瘤体积更小，并且均存在显著差异。这表明本发明提供的fc融合蛋白pd1/fgfr1相对于pd1/fc融合蛋白、fgfr1/fc融合蛋白具有更为显著的抑制肿瘤生长、降低肿瘤体积的作用。(2)fc融合蛋白pd1/fgfr1对瘤重的影响表2各组给药30d后的瘤重(g)组别生理盐水佐剂生理盐水组fgfr1/fc组pd1-fc组pd1/fgfr1/fc组小鼠12.752.861.061.160.86小鼠22.892.791.051.240.93小鼠33.163.041.371.180.81小鼠43.062.691.410.910.99小鼠53.22.811.181.350.87平均瘤重3.012.841.211.170.89p值-0.132.86×e-72.30×e-72.30×e-6抑瘤率-5.8％59.7％61.2％70.4％各组小鼠连续给药30d后的瘤重如图7所示，具体瘤重以及抑瘤率如表2所示。如图7和表2所示，pd1/fgfr1/fc组、fgfr1/fc组、pd1/fc组与生理盐水组或佐剂生理盐水组相比，肿瘤重量存在显著差异，表明fc融合蛋白pd1/fgfr1、fgfr1/fc融合蛋白以及pd1/fc融合蛋白均具有显著的抑制肿瘤生长、杀伤肿瘤的作用。还可以看出，pd1/fgfr1/fc组相对于fgfr1/fc组、pd1/fc组而言，其给药30d后的瘤重更低，抑瘤率达到70.4％，即表明fc融合蛋白pd1/fgfr1与fgfr1/fc融合蛋白、pd1/fc融合蛋白相比具有更为显著的肿瘤抑制作用，疗效显著。综上所述，本次试验建立4t1乳腺癌肿瘤模型对fc融合蛋白pd1/fgfr1进行抗肿瘤作用观察，结果发现fc融合蛋白pd1/fgfr1作为抗肿瘤药物(单独fgfr1/fc融合蛋白、pd1/fc融合蛋白、生理盐水佐剂和生理盐水组作为对照)可以有效治疗肿瘤，明显抑制肿瘤生长，肿瘤体积明显减小，肿瘤瘤重明显减轻；单独fgfr1/fc融合蛋白、pd1/fc融合蛋白免疫治疗具有一定的抗肿瘤作用但其抗肿瘤效果不如本发明提供的fc融合蛋白pd1/fgfr1的作用显著。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>海南医学院<120>fc融合蛋白pd1/fgfr1及其应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2242<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aagcttcgaggtccccaatgggccctggaggtccctcaccttctacccagcctggctcac60agtgtcagagggagcaaatgccaccttcacctgcagcttgtccaactggtcggaggatct120tatgctgaactggaaccgcctgagtcccagcaaccagactgaaaaacaggccgccttctg180taatggtttgagccaacccgtccaggatgcccgcttccagatcatacagctgcccaacag240gcatgacttccacatgaacatccttgacacacggcgcaatgacagtggcatctacctctg300tggggccatctccctgcaccccaaggcaaaaatcgaggagagccctggagcagagctcgt360ggtaacagagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcgcccaaaccaga420aggccggtttcaaggcatgggtggaggttcgggtggaggttcaggtggaggttctaggcc480agccccaaccttgcctgaacaagctcagccctggggagtccctgtggaagtggagtctct540cctggtccaccctggcgacctgctacagcttcgctgtcggcttcgcgatgatgtgcagag600catcaactggctgcgggatggggtgcagctggtggagagcaaccgtacccgcatcacagg660ggaggaggtggaggtgcgggactccatccccgctgactctggcctctacgcttgcgtgac720cagcagcccctctggcagcgataccacctacttctccgtcaatgtctcagatgcactccc780atcctcggaagatgatgacgacgacgatgactcctcctcggaggagaaagagacggacaa840caccaaaccaaaccgtaggcctgtagctccctactggacatccccagagaaaatggagaa900gaaactgcatgcggtgcccgctgccaagacggtgaagttcaagtgcccgtcgagtgggac960acccaaccccactctgcgctggttgaaaaatggcaaagagtttaagcctgaccaccgaat1020tggaggctacaaggttcgctatgccacctggagcatcataatggattctgtggtgccttc1080tgacaagggcaactacacctgcatcgtggagaatgagtatgggagcatcaaccacaccta1140ccagcttgacgtcgtggaacgatctccgcaccgacccatccttcaggcagggctgcctgc1200caacaagacagtggccctgggcagcaatgtggagttcatgtgtaaggtgtacagcgatcc1260gcagcctcacattcagtggctgaagcacatcgaggtgaacgggagtaagatcgggccaga1320caacttgccgtatgtccagatcctgaagactgctggagttaataccaccgacaaggaaat1380ggaggtgcttcatctacggaatgtctcctttgaggatgcgggggagtatacgtgcttggc1440gggtaactctatcggactctcccatcactctgcatggttgaccgttctggaagccctgga1500agagagaccagctgtgatgacctcaccgctctacctggaggatcccagagggcccacaat1560caagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtctt1620catcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatg1680tgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaa1740cgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccg1800ggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatg1860caaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagg1920gtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaa1980acaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtg2040gaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctga2100tggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaa2160tagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagctt2220ctcccggactccgggtaaatga2242<210>2<211>432<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaggtccccaatgggccctggaggtccctcaccttctacccagcctggctcacagtgtca60gagggagcaaatgccaccttcacctgcagcttgtccaactggtcggaggatcttatgctg120aactggaaccgcctgagtcccagcaaccagactgaaaaacaggccgccttctgtaatggt180ttgagccaacccgtccaggatgcccgcttccagatcatacagctgcccaacaggcatgac240ttccacatgaacatccttgacacacggcgcaatgacagtggcatctacctctgtggggcc300atctccctgcaccccaaggcaaaaatcgaggagagccctggagcagagctcgtggtaaca360gagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcgcccaaaccagaaggccgg420tttcaaggcatg432<210>3<211>1100<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggtggaggttcgggtggaggttcaggtggaggttctaggccagccccaaccttgcctgaa60caagctcagccctggggagtccctgtggaagtggagtctctcctggtccaccctggcgac120ctgctacagcttcgctgtcggcttcgcgatgatgtgcagagcatcaactggctgcgggat180ggggtgcagctggtggagagcaaccgtacccgcatcacaggggaggaggtggaggtgcgg240gactccatccccgctgactctggcctctacgcttgcgtgaccagcagcccctctggcagc300gataccacctacttctccgtcaatgtctcagatgcactcccatcctcggaagatgatgac360gacgacgatgactcctcctcggaggagaaagagacggacaacaccaaaccaaaccgtagg420cctgtagctccctactggacatccccagagaaaatggagaagaaactgcatgcggtgccc480gctgccaagacggtgaagttcaagtgcccgtcgagtgggacacccaaccccactctgcgc540tggttgaaaaatggcaaagagtttaagcctgaccaccgaattggaggctacaaggttcgc600tatgccacctggagcatcataatggattctgtggtgccttctgacaagggcaactacacc660tgcatcgtggagaatgagtatgggagcatcaaccacacctaccagcttgacgtcgtggaa720cgatctccgcaccgacccatccttcaggcagggctgcctgccaacaagacagtggccctg780ggcagcaatgtggagttcatgtgtaaggtgtacagcgatccgcagcctcacattcagtgg840ctgaagcacatcgaggtgaacgggagtaagatcgggccagacaacttgccgtatgtccag900atcctgaagactgctggagttaataccaccgacaaggaaatggaggtgcttcatctacgg960aatgtctcctttgaggatgcgggggagtatacgtgcttggcgggtaactctatcggactc1020tcccatcactctgcatggttgaccgttctggaagccctggaagagagaccagctgtgatg1080acctcaccgctctacctgga1100<210>4<211>697<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttggg60tggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgag120ccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcag180ctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggatta240caacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtgg300caaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccat360ctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaaga420agagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaaga480catttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaacc540agtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaa600ctgggtggaaagaaatagctact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