本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及pegfp-n1/sept8真核表达载体及构建方法及sept8基因干扰片段和应用。
背景技术：
septin8(sept8)基因定位于人染色体5q31.1，是septin基因家族成员之一。septin蛋白是构成细胞骨架的主要成分，并在细胞内物质运输、细胞分裂、细胞周期调控与凋亡等过程中发挥重要作用。近年来发现sept8在鳞状细胞癌(scc)等恶性肿瘤中呈高表达状态，并且与患者预后不良相关。迄今为止，尚未见sept8在胃癌细胞中的表达以及细胞功能实验研究的报道。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供pegfp-n1/sept8真核表达载体。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供pegfp-n1/sept8真核表达载体的构建方法。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供sept8基因的sirna干扰片段。
本发明的目的之四在于针对现有技术的不足，提供sept8基因的sirna干扰片段的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供pegfp-n1/sept8真核表达载体，所述pegfp-n1/sept8真核表达载体的序列具有seqidno:1所示的序列。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供pegfp-n1/sept8真核表达载体的构建方法，它包括以下步骤：
步骤一，在ncbi上查找sept8(nm_001098811.1)的序列作为目的基因序列，然后设计出引物sept8-p1、sept8-p2；其中，引物sept8-p1的序列具有seqidno:2所示的序列，引物sept8-p2的序列具有seqidno:3所示的序列；所述目的基因序列具有seqidno:4所示的序列；
步骤二，用引物sept8-p1、sept8-p2扩增目的基因序列，其中，目的基因序列的两端分别含酶切位点nhei和hindiii；
步骤三，目的基因序列经nhei和hindiii消化后与载体pegfp-n1连接，得到重组载体pegfp-n1/sept8，即为所述pegfp-n1/sept8真核表达载体。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
提供sept8基因的sirna干扰片段，包括sirna1、sirna2、sirna3和sirna4四个干扰片段；
所述sirna1干扰片段具有seqidno:5所示的序列；
所述sirna2干扰片段具有seqidno:6所示的序列；
所述sirna3干扰片段具有seqidno:7所示的序列；
所述sirna4干扰片段具有seqidno:8所示的序列。
为了实现上述目的之四，本发明采用如下技术方案：
提供sept8基因的sirna干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
(1)本发明的pegfp-n1/sept8真核表达载体，该pegfp-n1/sept8真核表达载体转染胃癌细胞后，对细胞增殖和克隆形成无明显影响，但能提高细胞横向和纵向迁移率，并能提高细胞的侵袭率。
(2)本发明的pegfp-n1/sept8真核表达载体的构建方法，该pegfp-n1/sept8真核表达载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。
(3)本发明提供的sept8基因的sirna干扰片段，转染胃癌细胞后，对细胞增殖和克隆形成无明显影响，但能降低细胞横向和纵向迁移率，并能降低细胞的侵袭率。
(4)本发明提供的sept8基因的sirna干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用，具有深远的开发价值。
附图说明
图1是pegfp-n1表达载体的图。
图2是rt-qpcr检测过表达sept8的mrna表达改变图。
图3是westernblot检测过表达sept8后蛋白的改变图。
图4是cck-8检测过表达sept8对细胞增殖的影响图。
图5是平板克隆形成实验图。
图6是细胞划痕实验：实验组细胞愈合明显比对照组快的对比图。
图7是transwell细胞迁移实验检测过表达sept8对细胞迁移的影响图。其中，*：p<0.05。
图8是transwell细胞侵袭实验检测过表达sept8对细胞迁移的影响图。其中，*：p<0.05。
图9是rt-qpcr检测sept8基因干扰片段干扰效率的结果图。其中，*：p<0.05。
图10是westernblot检测干扰sept8基因后蛋白改变的结果图。其中，*：p<0.05。
图11是干扰sept8基因后对mgc-803细胞增殖的影响图。
图12是干扰sept8基因后对mgc-803细胞克隆形成的影响图。
图13是干扰sept8基因后对mgc-803细胞横向迁移的影响图。其中，*：p<0.05。
图14是干扰sept8基因后对mgc-803细胞纵向迁移的影响图。其中，*：p<0.05。
图15是干扰sept8基因后对mgc-803细胞侵袭的影响图。其中，*：p<0.05。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
其中，本发明提及的ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)是指美国国立生物技术信息中心。
实施例1。
pegfp-n1/sept8真核表达载体，该pegfp-n1/sept8真核表达载体的序列具有seqidno:1所示的序列。
实施例2。
实施例1的pegfp-n1/sept8真核表达载体的构建方法，它包括以下步骤：
步骤一，在ncbi上查找sept8(nm_001098811.1)的序列作为目的基因序列，然后设计出引物sept8-p1、sept8-p2；其中，引物sept8-p1的序列具有seqidno:2所示的序列，引物sept8-p2的序列具有seqidno:3所示的序列；所述目的基因序列具有seqidno:4所示的序列；
步骤二，用引物sept8-p1、sept8-p2扩增目的基因序列，其中，目的基因序列的两端分别含酶切位点nhei和hindiii；
步骤三，目的基因经nhei和hindiii消化后与真核表达载体pegfp-n1连接，得到重组载体pegfp-n1/sept8，即为所述pegfp-n1/sept8真核表达载体。
实施例3。
实施例2的sept8基因的sirna干扰片段，包括sirna1、sirna2、sirna3和sirna4四个干扰片段；
sirna1干扰片段具有seqidno:5所示的序列；
sirna2干扰片段具有seqidno:6所示的序列；
sirna3干扰片段具有seqidno:7所示的序列；
sirna4干扰片段具有seqidno:8所示的序列。
实施例4。
实施例3的sept8基因的sirna干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用。
实验：
1.1sept8基因在胃癌细胞的过表达验证
把构建的pegfp-n1/sept8真核表达载体转染胃癌细胞，转染24h后提取rna，48h后提蛋白，分别用rt-qpcr、wb验证过表达是否成功。rt-qpcr实验结果显示，过表达sept8组的mrna表达水平明显升高(p<0.001，图2)。wb结果显示，过表达sept8后sept8蛋白水平明显升高(图3)，表明sept8基因在胃癌细胞内成功过表达。
引物如下表1：
表1
1.2过表达sept8对mgc-803细胞功能的影响
质粒转染48h后，收集细胞，分别检测实验组和对照组的细胞各项生物学行为指标，结果如下：
1)用cck-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验，检测过表达sept8对细胞增殖和克隆形成的影响
1.0×103细胞均匀布于96孔板内，每组5复孔，分别于0h，24h，48h，72h测cck8，cck-8细胞增殖实验结果显示：与对照组相比，过表达sept8组的细胞增殖速度无明显变化(p>0.05，图4)；1.0×103细胞均匀布于6孔板内，每组3复孔，十天后将细胞固定、染色、拍照，平板克隆形成实验结果显示：与对照组相比，实验组集落形成的数量无明显变化(p>0.05，图5)。
2)采用细胞划痕实验检测过表达sept8对细胞横向迁移的影响
待6孔板内细胞汇合度达100％，利用枪头在孔内划痕，于0h，24h，48h进行拍照，细胞划痕实验结果显示：过表达sept8组的细胞迁移速率明显高于对照组(图6)。
3)采用transwell细胞迁移实验检测过表达sept8对细胞纵向迁移的影响
5.0×104细胞用200μldmen培养基重悬，均匀布于transwell小室内，小室下加入800μl含10％血清dmen，6h后将细胞固定、染色、拍照。迁移实验结果显示：过表达sept8组的细胞迁移率明显高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05，图7)。
4)采用transwell细胞侵袭实验检测过表达sept8对细胞侵袭能力的影响
按8:1的比例混匀dmen培养基与凝胶，每个transwell小室加入60μl混合液，然后将小室放入37℃孵育1h，5.0×104细胞用200μldmen培养基重悬，均匀布于transwell小室内，小室下加入800μl含10％血清dmen，24h后将细胞固定、染色、拍照。侵袭实验结果显示：过表达sept8组的细胞迁移率明显高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05，图8)。
1.3合成并验证sept8的sirna干扰片段
分别合成sirna干扰片段干扰sept8在mgc-803的表达。rt-qpcr结果显示，分别转染sept8的条干扰片段，sirna1，sirna2，sirna3，sirna4四个干扰片段都有干扰作用(p<0.001，图9)，其中sirna4干扰效果最好，选择sirna4做后续实验。westernblot结果显示，转染sept8的sirna干扰片段后，干扰组中sept8蛋白的表达水平明显减少(图10)。
1.4干扰sept8对mgc-803细胞增殖、迁移和侵袭的影响
1)干扰sept8对mgc-803细胞增殖的影响
1.0×103细胞均匀布于96孔板内，每组5复孔，分别于0h，24h，48h，72h测cck8，cck-8细胞增殖实验结果显示：与对照组nc-sept8相比，干扰组细胞的增殖速度没有明显变化(p>0.05，图11)；1.0×103细胞均匀布于6孔板内，每组3复孔，十天后将细胞固定、染色、拍照，平板克隆形成实验结果显示：与对照组相比，干扰组的细胞克隆形成数量没有明显变化(p>0.05，图12)。
2)干扰sept8对mgc-803细胞横向迁移的影响
采用细胞划痕实验检测干扰sept8对细胞横向迁移的影响。待6孔板内细胞汇合度达100％，利用枪头在孔内划痕，于0h，24h，48h进行拍照，细胞划痕实验结果显示：干扰组的细胞迁移速率明显低于对照组(图13)。
3)采用transwell细胞迁移实验检测干扰sept8对细胞纵向迁移的影响
5.0×104细胞用200μldmen培养基重悬，均匀布于transwell小室内，小室下加入800μl含10％血清dmen，6h后将细胞固定、染色、拍照。迁移实验结果显示：干扰组的细胞迁移率明显低于对照组，差异有统计学意义(p<0.05，图14)。
4)采用transwell细胞侵袭实验检测干扰sept8对细胞侵袭能力的影响
按8:1的比例混匀dmen培养基与凝胶，每个transwell小室加入60μl混合液，然后将小室放入37℃孵育1h，5.0×104细胞用200μldmen培养基重悬，均匀布于transwell小室内，小室下加入800μl含10％血清dmen，24h后将细胞固定、染色、拍照。侵袭实验结果显示：干扰组的细胞迁移率明显低于对照组，差异有统计学意义(p<0.05，图15)。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
基因序列表
<110>广东医科大学
<120>pegfp-n1/sept8真核表达载体及构建方法及sept8基因干扰片段
<160>8
<210>seqidno:1
<211>6163
<212>dna
<213>pegfp-n1/sept8
<400>seqidno:1
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