一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法与流程

文档序号：15762762发布日期：2018-10-26 19:31阅读：584来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及药品和生物制品(包括基因工程制品)中热原的检测技术领域.

背景技术：

热原是一类在宿主体内可以引起发热和诱导炎症反应的异构类化合物。药品和医疗器械热原的污染是系统性炎症最常见的原因，甚至更糟糕的是会引起败血性休克(palma,l.,etal.assaydrugdevtechnol,2017.15(2):64-76.；gimenes,i.,etal.regultoxicolpharmacolm,2015.73(1):356-360.)。大多数为我们所知道的热原是微生物来源的，包括细菌，酵母，真菌，病毒和它们的组分以及环境颗粒(daneshian,m.,etal.jimmunolmethods,2008.336(1):64-70.)。研究最好的是细菌细胞壁的组分，例如革兰氏阴性菌的脂多糖(lps，也被称为内毒素)或者革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(lta)和肽聚糖(pgn)(daneshian,m.,etal.jimmunolmethods,2008.336(1):64-70.；stang,k.,etal.jmaterscimatermed,2014.25(4):1065-1075.)，这些热原物质会刺激宿主的白细胞去释放炎症细胞因子和导致严重的反应，如多器官衰竭，败血性休克甚至死亡(stang,k.,etal.jmaterscimatermed,2014.25(4):1065-1075.；hasiwa,n.,m.daneshian,andt.hartung,2013.30(2):169-209.)。因此，热原检测是一个医药产品的先决条件。目前，几种不同的检测热原方法可以被获得，分别是家兔热原检测法(rpt)，细菌内毒素检测法(bet，也被称为鲎试剂法(lal))，和单核细胞检测法(mat)(stang,k.,etal.jmaterscimatermed,2014.25(4):1065-1075.)。

家兔热原检测法(rpt)，一个黄金的热原检测标准，它是基于在静脉注射待检测的溶液或者移植医疗器械之后观察家兔温度的上升情况(stang,k.,etal.jmaterscimatermed,2014.25(4):1065-1075.；su,w.andx.ding,2015.20(4):354-364.)。在二十世纪初，由于家兔对热原的灵敏度和人类的灵敏度是相似的(vipond,c.,etal.,altex,2016.33(1):47-53.)，因此，rpt被应用于检测不同类型的热原污染(palma,l.,etal.assaydrugdevtechnol,2017.15(2):64-76.)。然而，家兔的灵敏度容易受到很多因素影响，例如家兔的品系，年龄和性别以及饲养条件等(stang,k.,etal.jmaterscimatermed,2014.25(4):1065-1075.)。而且，rpt是既昂贵又费时的。除此之外，家兔法仅仅是定性检测而不是定量的(hasiwa,n.,m.daneshian,andt.hartung,2013.30(2):169-209.)。

细菌内毒素检测法(bet)是一种可替代家兔的体外质量控制方法，它主要检测革兰氏阴性菌的内毒素，这是基于鲎变形细胞溶解产物所引起的凝胶酶联级联反应，并因此它也被称为鲎试剂检测法(novitsky,t.j.,biologyandconservationofhorseshoecrabs,2009:315-329.)。和家兔法相比，lal法可以对内毒素进行半定量或者定量检测，甚至是在飞克水平。然而，lal的结果会被蛋白酶所影响。lal也会对一些聚合形式的糖展现出反应活性，例如存在于真菌，藻类和酵母细胞内的3-葡聚糖。尽管β-(1,3)-d-葡聚糖不是热原性的物质，但是它可以诱导凝胶级联反应，然后干扰lal对lps的反应(su,w.andx.ding,2015.20(4):354-364.；ding,j.l.andb.ho,trendsinbiotechnology,2001.19(8):277-281.)。此外，这种检测方法对lps的反应和人的免疫反应是极度不同的。因此，lal检测不可能完全取代家兔法(hasiwa,n.,m.daneshian,andt.hartung,2013.30(2):169-209.)。

随着人们对动物福利问题的日益关注，上述传统的两种热原检测方法对于产品的质量控制正面临严峻的挑战。最近，一种rpt或者lal的替代方法逐渐发展起来，也就是单核细胞激活检测(mat)(wunderlich,c.,s.schumacher,andm.kietzmann,bmcpharmacologyandtoxicology,2014.)。mat是基于热原激活人单核细胞和利用酶联免疫吸附实验测量细胞因子的释放，例如il-1β，il-6，tnf-α，而且这些细胞因子的释放是与人的发热反应是相似的(gimenes,i.,etal.regultoxicolpharmacolm,2015.73(1):356-360.)。目前，尽管单核细胞激活检测法似乎更符合要求：不使用动物，能真实模拟人体对热原的反应，并且能定量或半定量地检测出较多种类的热原物质，操作简便等(hartung,t.,altex,2015.32(2):79-100.)，但其需要找到合适的细胞，目前研究比较热门的细胞如mm6亚克隆细胞，较难得到，不适合广泛的推广，而thp-1细胞灵敏度较低。因此，利用细胞系法进行热原检测存在许多亟待解决的问题，而寻找新的热原检测方法仍然是迫在眉睫。

内毒素是最强有力的细菌细胞因子的诱导子。在感染过程中，热原刺激人的单核细胞去合成或者释放炎症细胞因子，包括il-1β，il-6，tnf-α(cavaillon,j.m.,toxicon,2017.；j.j.lee,etal.,japanesejournalofphysiology,2003.53:367-375.；nakagawa,y.,h.maeda,andt.murai,clinicalandvaccineimmunology,2002.9(3):588-597.)。而nf-κb又是调控编码促这些炎性细胞因子基因的一个主要的转录因子。而且，已经有证据表明阻止nf-κb的激活也许是治疗发热的有效策略(j.j.lee,etal.,japanesejournalofphysiology,2003.53:367-375.；barnes,p.j.andm.karin,newenglandjournalofmedicine,1997.)。与此同时，在正常的家兔体内，人的β-干扰素可以显著性增加这种由内毒素引起的发热反应，它是通过增强tnf依赖的tnf的产生来实现的(kawasaki,h.,etal.,infectionandimmunity,1987.55(11):2574-2578.；kawasaki,h.,etal.,infectionandimmunity,1989.57(10):3131-3135.；kawasaki,h.,m.moriyama,andh.nariuchi.,infectionandimmunity,1992.60(3):933-936.)，并且也可以使热原耐受的家兔恢复正常的由内毒素引起的发热反应(kawasaki,h.,m.moriyama,anda.tanaka.,infectionandimmunity,1987.55(5):1121-1125.；beesonandp.b.,j.exp.med.,1947:29-38.；greisman,s.e.,andr.b.hornick.,j.infect.dis.,1973.128(supplement):s265-s276.)。因此，通过检测模仿人体对病原体正常生理反应的nf-κb或者β-ifn的激活可以反映出它下游的细胞因子的产生。

以前的报道已经表明：细菌鞭毛可以通过toll样受体tlr5刺激人肺泡上皮细胞产生细胞因子il-8(im,j.,etal.,molimmunol,2009.47(2-3):614-622.；lopez-boado,y.s.,etal.,infectimmun,2005.73(11):7525-7534.)。这就说明人肺泡上皮细胞也许可以作为我们用于热原检测的细胞系。但是，其他的热原物质究竟是如何诱导激活肺上皮细胞还没有完全被阐释清楚。因此，在我们的研究中，我们致力于去开发一种通过利用荧光素酶报告系统和人肺泡上皮细胞系a549以便稳定、灵敏、快速地检测热原的细胞学方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中检测热原的方法灵敏度低，稳定性差，检测周期长，以及检测用的mm6亚克隆细胞和人全血，较难得到，不适合广泛的推广等缺陷，提供一种使用人上皮细胞系检测热原的方法，所述的方法能够快速、灵敏和稳定的检测热原，而且所用的a549细胞市售易获得。

发明人经过广泛的研究和反复的试验，发现a549细胞在经过本发明方法培养后对热原物质敏感，能够用于细胞系法检测热原，因此发明人发明了一种使用人上皮细胞系检测热原的方法。

本发明提供一种使用人上皮细胞系检测热原的方法，其包括以下的步骤：

(1)将nf-κb或者ifn-β基因组装到可表达嘌呤霉素的慢病毒表达载体中，构建含有nf-κb基因的重组质粒；

(2)将步骤(1)所述的含有nf-κb或者ifn-β基因的重组质粒稳定转染到上皮细胞系中；

(3)将步骤(2)所述的含有nf-κb或者ifn-β基因重组质粒的稳定转染得到的上皮细胞系使用嘌呤霉素筛选，并用流式分选单克隆；

(4)将步骤(3)所述的分选得到的单克隆使用高剂量的lps刺激，其中对lps有反应的则为nf-κb或者ifn-β阳性克隆子；

(5)将步骤(4)所述的nf-κb或者ifn-β阳性克隆子使用更低剂量的lps刺激，得到极灵敏的阳性克隆。

(6)将步骤(4)所述的nf-κb阳性克隆子再使用细菌内毒素标准品刺激，并和鲎试剂进行比较。

优选地，所述的nf-κb或者ifn-β基因分别位于pnfκb-luc或者pgl3-control质粒上。

进一步地，步骤(1)中所述的慢病毒表达载体为pcdh-cmv-mcs-ef1系列载体。

进一步地，所述的上皮细胞系为人肺泡上皮细胞a549。

进一步地，步骤(4)中所述的高剂量的lps其浓度为500ng/ml；所述的对lps有反应是通过荧光素酶报告实验测定。

进一步地，步骤(5)中所述的更低剂量lps在刺激nf-κb或者ifn-β阳性克隆子其浓度分别为1,10,50，100ng/ml或者10,25，50，100ng/ml。

进一步地，步骤(6)中所述的细菌内毒素标准品其浓度为0.1,0.25,0.5，1eu/ml；所述的鲎试剂其灵敏度为0.125eu/ml。

进一步地，上述所述的lps刺激的时间为6h。

本发明还提供一种上述的方法去检测热原的方法，所述的检测热原的方法是人肺泡上皮细胞a549通过荧光素酶报告实验测定500ng/mllps刺激后的反应。

本发明的有益效果在于：本发明所述的上皮细胞系检测热原的方法不需要使用动物就能够真实地模拟人体对热原的反应，并且能够对的分布范围极为广泛的lps有较强的反应，灵敏度高，稳定性好，反应迅速，而且a549细胞市售易得使该热原检测方法简单易行。同时本发明的细胞模型最低检测限可达0.1eu/ml，低于鲎试剂法的0.125eu/ml，即最常用的检测限度，低于人的发热阈值0.3eu/ml。

附图说明

图1pcdh-cmv-puro的质粒图谱。

图2pnf-κb-luc的质粒图谱。

图3pgl3-ifn-β-luc的质粒图谱。

图4pcdh-puro-nf-κb/ifn-β质粒的酶切鉴定图谱。

图5nf-κb报告细胞筛选的一次代表性结果图。

图6ifn-β报告细胞筛选的一次代表性结果图。

图7几次筛选得到的nf-κb阳性克隆子3#，8#，123#，191#的荧光结果图。

图8几次筛选得到的ifn-β阳性克隆子33#的荧光结果图。

图9nf-κb基因的pcr图。

图10ifn-β基因的pcr图。

图11nf-κb报告细胞克隆3#，8#，123#，191#在不同剂量lps刺激后的荧光结果图。

图12ifn-β报告细胞克隆33#在不同剂量lps刺激后的荧光结果图。

图13nf-κb报告细胞3#，8#，123#，191#在高剂浓度rse刺激后的荧光结果图。

图14nf-κb报告细胞克隆3#，8#在不同浓度rse刺激后的荧光结果图。

图15不同浓度内毒素标准品和lal发生凝胶反应的结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

材料、试剂和仪器

细胞培养基：dmem培养基(购自上海源培生物科技股份有限公司)500ml，加入胎牛血清(购自gibco)50ml混匀即可，也即是完全dmem培养基。

细胞：a549购自北京协和医学院(编号：ccl-185^tm)。

质粒：pnf-κb-luc购自碧云天生物科技公司；pgl3-control-vector(pgl3-ifn-β-luc)由武汉大学舒红兵老师提供；pcdh-cmv-mcs-ef1-puro购自美国systembiosciences；pcdh-puro-nf-κb/ifn-β由本实验室自行构建。

试剂：嘌呤霉素(puromycin)购自amreco公司；来自大肠杆菌0111：b4类型的脂多糖(lps)都是购自美国sigma公司；来自大肠杆菌0111：b4类型的内毒素标准品(rse)和0.125eu/ml鲎试剂lal都是购自中国食品药品检定研究院；单荧光试剂盒购自promega公司。

耗材：细胞计数板、无菌塑料离心管(1.5ml、50ml)、一次性塑料移液管(无菌，单包装，10ml)、10cm培养皿，6孔或48孔或96孔细胞培养板。

仪器:

37℃细胞恒温co2培养箱：mco-15ac，sanyo公司；centrifuge5424r离心机：5404dj914920，eppendorf公司；glomaxmulti多功能检测仪：e6080glomax，promega公司；pcr仪：美国biorad公司。

本发明所涉及到所有单克隆细胞的培养与传代均与a549细胞相同。

实施例1重组质粒和重组细胞的构建

1慢病毒重组质粒的构建

慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-puro(简写为pcdh-cmv-puro)作为原始的载体被使用去构建报告基因，如图1所示。pcdh-cmv-puro和pnf-κb-luc或pgl3-ifn-β-luc(图2和图3所示)分别用spei和bamhi限制性内切酶进行酶切，跑胶割胶回收，回收之后在进行连接，转化涂板等一系列操作。次日，每种质粒挑取10个克隆做菌落pcr，跑dna胶，从中把阳性克隆摇菌，待pcdh-puro-nf-κb/ifn-β菌体长到16～18h，菌体浑浊不透明即可中提质粒，按照高纯度小提中量试剂盒的说明书要求操作即可。当质粒提取完成且也测量完浓度后，各从中取出1μg用来做酶切鉴定，其酶切鉴定图如图4所示。鉴定正确后送测序(pcdh-puro-nf-κb的序列和pcdh-puro-ifn-β的序列)，并从pubmed基因数据库中检索相匹配的基因克隆。

2细胞传代培养和铺板

a549细胞使用所述细胞培养基传代培养于5％，37℃二氧化碳培养箱内，每2～3天传代一次，收集入无菌离心管中，900rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用新鲜的细胞培养液重悬，取出一部分转入细胞培养皿，继续培养。取生长状态良好的细胞进行铺板，900rpm离心5分钟，弃上清，加入完全dmem培养基的细胞培养液重悬，得细胞悬浮液。调节细胞浓度为6×10⁵个/ml或2.5×10⁵个/ml，以100μl/孔加入到48或96孔培养板中，需再分别补加400μl或100μl培养基到培养孔中。

3慢病毒的包装和筛选

慢病毒重组质粒构建成功后，也就是说，cmv启动子编码的序列从原始的载体上切除，同时被带有nf-κb结合位点或者ifn-β启动子的萤火虫荧光素酶编码的序列所取代。这说明构建好的pcdh-puro-nf-κb/ifn-β慢病毒质粒都含有了荧光素酶基因序列，这是有利于后续实验的进行的。

接下来我们就要先包装慢病毒，以6cmdish包装为例来说一下具体的包装步骤。

(1)转染前半小时，37℃预热无血清无抗生素的dmem和完全(10％fbs)的dmem培养基；

(2)取2.3μg慢病毒重组质粒pcdh-puro-nf-κb/ifn-β和2.3μg辅助质粒，3个辅助质粒分别为0.75μgpgag-pol，0.23μgprev，1.38μgpvsvg)稀释于100μl无血清无抗生素的dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；

(3)取9.2μlpei稀释于100μl无血清无抗生素的dmem中，轻轻混匀，室温静置5min；

(4)将上述两个溶液混在一起，轻轻混匀(上下颠倒或者用1000μl移液器轻轻吹打)，室温孵育20～25min，以形成dna-pei复合物；

(5)取出提前一天铺好的293t细胞，吸去原有培养基，每个6cmdish中加入2.5ml新鲜的完全dmem培养基；

(6)将dna-pei复合物加入到6cmdish中，轻轻混匀；

(7)放在含有5％co2的37℃培养箱中孵育培养48h，其中在6～8h时再在每个6cmdish补加2.5ml新鲜的完全dmem培养基；

(8)待到48h后，收取6cmdish中293t细胞的上清，即为慢病毒颗粒液。

收集的慢病毒颗粒，用0.22μm的滤膜过滤去除细胞碎片和杂质，然后和10μg/ml助转剂polybrene以及补加的血清一起加入准备好的a549细胞。感染48h后，用嘌呤霉素筛选耐受的细胞筛选三天，筛选过后细胞存活的很少，接着需要用半定量的嘌呤霉素维持细胞培养3～5天。

4单克隆的分选和选择

把6cm培养皿中的细胞用流式分选单克隆细胞，置于提前加好培养基的96孔培养板中(含有嘌呤霉素)，分选完成后，2000rpm/min离心2min，放在5％co2，37℃培养箱中培养，7～15天后细胞开始陆陆续续长起来。然后就按照24孔板，12孔板，6孔板，6cmdish的顺序将细胞转移出来。

5阳性克隆子的确定

待单克隆长起来以后，采用高通量单荧光素酶报告实验来进行测量其报告基因有没有转进去。具体的操作步骤是：把每个长起来的单克隆均铺在96孔板中，次日上午用500ng/ml的lps刺激6h，刺激结束后，使用单荧光素酶报告基因试剂盒中的裂解液将细胞置于4℃摇床裂解细胞15min，然后2000rpm/min瞬离把细胞碎片离到板底，上清转移到96微孔板中，然后按照人工指导使用说明使用glomax(96microplateluminometer)测量荧光值。图5和6显示的nf-κb或者ifn-β的所有单克隆的一次分选结果，而图7和8是nf-κb或者ifn-β所有阳性克隆子的荧光测量结果。

测量得到的数值如果是两位数说明该克隆报告基因没有转进去，反之如果数值在三位数甚至四五位数则说明基因转进去了。因此，通过这种高通量的方式来检测细胞中基因表达情况是很方便和高效的。

实施例2验证nf-κb/ifn-β基因的插入

1.重组细胞rna提取和反转

我们主要使用trizol试剂提取rna，以6孔板为例，具体步骤如下：

(1)处理细胞：去除培养基后，向长有a549报告细胞的6孔板中加入1mltrizol试剂，将细胞吹下放入一个1.5ml的灭菌rna离心管中。

(2)分层：每1mltrizol加入200μl氯仿(三氯甲烷)，在振荡器上剧烈震荡15s，室温放置3～5min，12000rpm/min，4℃离心5min。

(3)rna沉淀：离心结束后，把上层水相(约500μl)转移到新的离心管中，宁少勿多，加入等体积冰冷的异丙醇(提前放入-20℃)，-20℃放置20min，12000rpm/min，4℃离心20min，弃上清。

(4)rna漂洗：rna沉淀中加入1ml75％乙醇，用手弹使沉淀悬浮，12000rpm/

min，4℃离心5min。去上清，重复该步骤一次，然后室温或者排风口放置1～2min晾干沉淀，注意不要太干，否则很难溶解。

(5)溶解rna：rna沉淀加入20μldepc水，轻弹管壁，37℃，3min或者4℃，30～60min溶解。

(6)测量rna浓度，然后储存于-80℃。整个过程可以在超净台也可以在外面进行，但一定要注意，防止rna降解以及其他的污染，所以要戴口罩，常喷酒精。

rna提取完成以后，接下来就是把rna反转成cdna。反转主要分为三步进行：首先，第一步，取pcr管，向管中加入1μg的rna，再加入1μloligodt或者randomprimer，最后补加depc水至5μl体系。然后放入pcr仪70℃运行5min。

第二步，从pcr仪中将pcr管取出置于冰上1min，然后依次加入4μl5×reactionbuffer，2μl2.5mmmgcl2，1μl10mmdntps，1μlreversetranscriptase，补加depc水至15μl体系。

第三步，按照程序：25℃，5min，42℃，60min，70℃，15min，4℃，90min放入pcr仪运行。待运行结束即得到的是cdna。

2.nf-κb/ifn-β基因的获得

将上述得到的cdna使用表1中的引物做pcr来鉴定这些报告细胞是否含有nf-κb/ifn-β基因。如图9和10所示，筛选得到的nf-κb/ifn-β报告细胞单克隆都含有nf-κb/ifn-β基因，这就说明我们构建的细胞是正确的，确实有目的基因的插入。

表1.pcr引物序列和pcr产物长度

实施例3验证a549阳性克隆可以用于检测热原

1.lps或内毒素标准品(rse)刺激

首先，把筛选出来的nf-κb/ifn-β报告细胞进一步使用不同剂量的lps。lps的储存浓度是1mg/ml，rse的原始浓度是10eu/ml。lps使用的剂量主要有1ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，100ng/ml，250ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，都用lps储存浓度稀释，结果如图11和12所示。

由实施例1中的结果可知，ifn-β克隆子较难获得，只有一个克隆，无法比较。因此，接下来的实验我们主要对nf-κb基因进行了内毒素标准品的验证。首先使用1eu/ml的rse对上述筛选得到的四株nf-κb阳性克隆子进行刺激，其结果如图13所示。接着。我们使用rse的剂量为0.1eu/ml，0.25eu/ml，0.5eu/ml，1eu/ml去刺激细胞，其结果如图14所示。

2.鲎试剂(lal)试验

根据人工指导说明要求，使用0.125eu/ml的lal(中国食品药品检定研究院)测量不同浓度(0，0.1，0.125，0.25，0.5，10eu/ml)的内毒素标准品，根据鲎试剂凝固以及浑浊的状态来测定内毒素的含量。从而和本发明的报告细胞形成一个鲜明的对比，从而也说明我们的报告细胞已经达到测量内毒素的灵敏度了，正如图14和15所示。

从上述实施例可以看出，本发明提供的上皮细胞系检测热原的方法，不需要使用动物就能够真实地模拟人体对热原的反应，并且能够对的分布范围极为广泛的lps有较强的反应，灵敏度高，a549细胞市售易得使该热原检测方法简单易行，并且其最低检测限低于鲎试剂，其敏感性更强，其稳定性又比利用人全血检测更高。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

安徽大学

中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心

<120>一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9249

<212>dna

<213>pcdh-puro-nf-κb的序列(人工序列)

<400>1

acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagca60

acatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggta120

cgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactga180

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tctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgctta300

agcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgact360

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<213>pcdh-puro-ifn-β的序列(人工序列)

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