十六元大环内酯类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于药物领域，涉及十六元大环内酯类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

多拉菌素为20世纪90年代研制开发的新一代大环内酯类抗寄生虫药，是以前体合成缺陷的阿维链霉菌突变株为发酵生产菌，加入前体物质环己羧酸合成的一种十六元大环内酯类抗生素。多拉菌素抗寄生虫范围广泛，在动物体内具有吸收迅速、生物利用度高、药物残效期长等优势，已在兽医临床应用于牛、马、绵羊、山羊、猪、犬等哺乳动物，是目前阿维菌素类最优秀的兽用抗寄生虫药物之一。

多拉菌素的生物合成途径大致可分为三个阶段：(1)起始单元的生物合成。阿维菌素的合成以异亮氨酸或缬氨酸为起始单元，由支链α酮酸脱氢酶基因簇(branched-chainαketoaciddehydrogenasegenecluster,bkdfgh)编码支链氨基酸脱氢酶复合体(bcdh)参与催化。通过在bcdh突变株中补加环己基羧酸作为起始单元底物，可生成多拉菌素；(2)糖苷配基的形成。在起始单元的基础上，7个乙酰和5个丙酰缩合而成聚酮长链，再经过一系列的修饰，形成阿维菌素糖苷配基；(3)糖苷配基的糖基化。首先葡萄糖-1-磷酸在avebiii和avebii的作用下首先形成tdp-4-酮-6-脱氧葡萄糖，然后在avebiv～avebviii的催化下合成dtdp-l-齐墩果糖，最后由avebi编码的糖基转移酶将dtdp-l-齐墩果糖转移到来源于聚酮的糖苷配基上，形成多拉菌素。糖基化修饰是多拉菌素生物合成的重要步骤。

研究表明，糖基化修饰在抗生素生物合成过程中广泛存在，例如红霉素、阿维菌素、多柔比星等，终产物都有糖基化修饰。糖基可以改善化合物的水溶性，且通常直接参与化合物与靶点的相互作用，与其生物活性紧密相关。不同种类、数目，甚至区域及立体选择性不同的糖基都会产生不同结构的产物。鉴于糖基在抗生素药理作用中起到的重要作用，糖基侧链的改造成为发现新药物的重要方法。在改造糖基化的研究中，催化糖基化的糖基转移酶发挥着重要的作用，发掘和定向改造糖基转移酶为改造糖基侧链、合成新结构的抗生素打下坚实的基础。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于防治农林害虫的新的十六元大环内酯类化合物。

为解决以上技术问题，本发明提供十六元大环内酯类化合物，其结构通式如式i所示：

其中，x-y为ch2-ch(oh)或ch＝ch，当x-y为ch2-ch(oh)时为本发明的化合物c240-1，当x-y为ch＝ch时为本发明的化合物c240-2；

所述化合物可以人工合成，也可以通过生物表达得到，所述生物可以为细菌，如链霉菌。

为解决以上技术问题，本发明还提供生产上述十六元大环内酯类化合物的链霉菌。

为解决以上技术问题，本发明还提供上述链霉菌的构建方法，包括以下步骤：以基因工程菌dm-209为出发菌株，将编码糖基转移酶的avebi基因失活，即得；

所述dm-209是以atccno:31267产阿维菌素的除虫链霉菌ma-4680(streptomycesavermilitilisma-4680)为出发菌株，通过和aved和bkdf基因失活获得的基因工程菌；

所述aved基因失活的方法优选参见国际公布日为2015年9月17日、发明名称为“表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途”的国际专利申请wo2015/135242a1的实施例1，得到aved基因失活突变株；

所述bkdf基因失活方法为bkdf基因同源重组双交换法。

上述方法中，所述bkdf基因同源重组双交换法包括以下步骤：将重组质粒pspd86转化大肠杆菌，得到转化子，再将所述转化子接合转移到所述aved基因失活突变株中，挑取同源重组双交换子；

所述重组质粒pspd86的构建包括以下步骤：用除虫链霉菌bkdf基因的同源重组左臂片段替换pspd1的hindiii和ecori酶切位点间片段，并且用bkdf基因的同源重组右臂片段替换其ecori和clai酶切位点间片段；

所述pspd1的序列如seqidno.3所示。

上述任一所述的方法中，所述bkdf基因的同源重组左臂片段是以所述除虫链霉菌基因组dna为模板，以seqidno.1和seqidno.2所示的dna片段为引物进行pcr扩增得到；

所述bkdf基因的同源重组右臂片段是以所述除虫链霉菌基因组dna为模板，以seqidno.4和seqidno.5所示的dna片段为引物进行pcr扩增得到。

上述任一所述的方法中，所述重组质粒pspd86的构建包括以下步骤：

用hindiii和ecori双酶切所述bkdf基因的同源重组左臂片段，得到左臂片段1’；用hindiii和ecori双酶切所述pspd1，得到载体片段1’；将所述左臂片段1’与所述载体片段1’连接，得到重组质粒pspd85；

用ecori和clai双酶切所述bkdf基因的同源重组右臂片段，得到右臂片段1’；用ecori和clai双酶切pspd85，得到载体片段2’；将所述右臂片段1’与载体片段2’连接，得到重组质粒pspd86。

上述任一所述的方法中，所述avebi基因失活的方法为avebi基因同源重组双交换法。

上述任一所述的方法中，所述avebi基因同源重组双交换法包括以下步骤：将重组质粒puab-2转化大肠杆菌，得到转化子，再将所述转化子接合转移到所述基因工程菌dm-209，挑取同源重组双交换子；

所述重组质粒puab-2的构建包括以下步骤：用除虫链霉菌avebi基因的同源重组左臂片段替换pspd1的hindiii和xbai酶切位点间片段，并且用avebi基因的同源重组右臂片段替换xbai和clai酶切位点间片段。

上述方法中，所述大肠杆菌为大肠杆菌et12567(escherichiacoliet12567)；

所述除虫链霉菌为除虫链霉菌ma-4680(streptomycesavermitilisma-4680)。

上述任一所述的方法中，所述avebi基因的同源重组左臂片段是以所述除虫链霉菌ma-4680基因组dna为模板，以seqidno.8和seqidno.9所示的dna片段为引物进行pcr扩增得到；

所述avebi基因的同源重组右臂片段是以所述除虫链霉菌ma-4680基因组dna为模板，以seqidno.10和seqidno.11所示的dna片段为引物进行pcr扩增得到；

所述重组质粒puab-2的构建包括以下步骤：用hindiii和xbai双酶切所述avebi基因的同源重组左臂片段，得到左臂片段1；用hindiii和xbai双酶切所述pspd1，得到载体片段1；将所述左臂片段1与所述载体片段1连接，得到重组质粒puab-1；

用xbai和clai双酶切所述avebi基因的同源重组右臂片段，得到右臂片段1；用xbai和clai双酶切puab-1，得到载体片段2；将所述右臂片段1与载体片段2连接，得到重组质粒puab-2；

最终获得的生产上述十六元大环内酯类化合物的链霉菌为本发明的基因工程菌dmb-240。

为解决以上技术问题，本发明还提供上述十六元大环内酯类化合物的制备方法，所述方法为化学制备法或生物制备法，其中所述生物制备法为发酵上述链霉菌。

为解决以上技术问题，本发明还提供如下(1)和/或(2)所述的物质在防治农林害虫中的应用：

(1)上述十六元大环内酯类化合物；

(2)上述链霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物；

所述十六元大环内酯类化合物优选为本发明的化合物c240-2。

上述应用中，所述农林害虫为鳞翅目粉蝶科中的一种或多种和/或垫刃目滑刃总科中的一种或多种。

上述应用中，所述鳞翅目粉蝶科的害虫为菜青虫；

所述垫刃目滑刃总科的害虫为松材线虫。

多拉菌素糖基改造可能是发现新的多拉菌素衍生物的一个途径，如想实现这一目标，构建相应的糖基转移酶突变体是十分重要的环节。根据上文所述，多拉菌素生物合成途径中糖基转移酶由avebi基因编码合成，为了失活糖基转移酶，本发明采取基因敲除的方法缺失糖基转移酶的编码基因avebi，意外获得了一类新的十六元大环内酯类化合物。本发明的这类化合物除预期的脱去糖基侧链外，c3-c4位双键发生移位，这是之前从未发现的结构，进一步的活性检测结果表明，其抗虫谱也发生变化，本发明的化合物在防治农林害虫中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中基因工程菌dm-209和dmb-240发酵液的hplc对比图；

其中，a为出发菌株基因工程菌dm-209的发酵液的hplc图谱，其中dm代表多拉菌素；b为基因工程菌dmb-240的发酵液的hplc图谱。

图2为本发明化合物c240-1的质谱图。

图3为本发明化合物c240-2的质谱图。

图4为本发明化合物c240-1的¹h-nmr谱图。

图5为本发明化合物c240-2的¹h-nmr谱图。

图6为本发明化合物c240-2的¹³c-nmr谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

dm-209是以产阿维菌素的除虫链霉菌ma-4680(streptomycesavermitilisma-4680)(atccno:31267)为出发菌株，通过bkdf和aved基因失活获得，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得，具体构建过程如下：

1、以除虫链霉菌ma-4680为出发菌，构建aved基因失活突变株，具体构建过程参见国际公布日为2015年9月17日、发明名称为“表达阿维菌素类似物的重组微生物及其用途”的国际专利申请wo2015/135242a1的实施例1。

2、构建bkdf基因失活突变株

1)根据除虫链霉菌的基因组序列设计并合成如下引物：

bkdf-1：5’-tgcaagcttcacggcgggcccctgacggttcgtc-3’(seqidno.1)

下划线所示序列为限制性内切酶hindiii酶切识别位点；

bkdf-2：5’-cgagaattcgtgtgctcctccgtcggtccggccc-3’(seqidno.2)

下划线所示序列为限制性内切酶ecori酶切识别位点；

以ma-4680菌株基因组dna为模板，以bkdf-1和bkdf-2为引物，pcr扩增得到bkdf基因的同源重组左臂片段；用hindiii和ecori双酶切所述bkdf基因的同源重组左臂片段，得到左臂片段1’；用hindiii和ecori双酶切pspd1(序列如seqidno.3所示)，得到载体片段1’；将所述左臂片段1’与所述载体片段1’连接，得到重组质粒pspd85。

2)根据除虫链霉菌的基因组序列设计并合成如下引物：

bkdf-3：5’-tcagaattccatggccgagaagatggcgatcgccaa-3’(seqidno.4)

下划线所示序列为限制性内切酶ecori酶切识别位点；

bkdf-4：5’-agcatcgatgctgtcgcagtcgaacctgaacctgga-3’(seqidno.5)

下划线所示序列为限制性内切酶clai酶切识别位点；

以ma-4680菌株基因组dna为模板，以bkdf-3和bkdf-4为引物，pcr扩增得到bkdf基因的同源重组右臂片段；用ecori和clai双酶切所述bkdf基因的同源重组右臂片段，得到右臂片段1’；用ecori和clai双酶切pspd85，得到载体片段2’；将所述右臂片段1’与载体片段2’连接，得到重组质粒pspd86。

3)按实施例1所描述的方法，通过接合转移将重组质粒pspd86转化到步骤1所构建的aved基因失活突变株中，筛选出氨普霉素敏感单菌落。

4)以ma-4680菌株基因组dna为模板，以bkdf-5：5’-tctcacacaggacccctatgtc-3’(seqidno.6)和bkdf-6：5’-gacaacggggagcttgatcttg-3’(seqidno.7)为引物进行pcr扩增，得到的扩增产物的条带大小为1971bp。以步骤3)筛选到的氨普霉素敏感菌株的基因组dna为模板，以bkdf-5和bkdf-6为引物进行pcr扩增，得到的扩增产物的条带大小为750bp，与理论大小一致，并将该菌送测序，结果与预期一致，证明其为同源重组双交换子(bkdf基因失活突变株)，即得基因工程菌dm-209。

大肠杆菌et12567(puz8002)(escherichiacoliet12567)为优宝生物公司产品，产品编号为st1130。

阿维菌素为浙江世佳科技有限公司产品，casno.:65195-55-3。

菜青虫(pierisrepae)在文献“林文彩,章金明,郦卫弟,等.不同杀虫剂对甘蓝上菜青虫和小菜蛾的防治效果.浙江农业科学,2015,56(7):1060-1062”中公开过，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。

松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)在文献“杨波,张邵勇,陈振等.新化合物天维菌素的杀虫杀螨活性。农药学学报,2016,18(1):124-129”中公开过，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。

实施例1、重组除虫链霉菌菌株dmb-240的构建

一、重组质粒puab-2的构建

(一)puab-1的构建

1、合成如下引物：

ab-1:5’-atcaagcttctgttcctgaagccatgagatgccgtcc-3’(seqidno.8)

下划线所示序列为限制性内切酶hindiii酶切识别位点；

ab-2:5’-tcttctagactctcactgcccatcgtcggaagatgtt-3’(seqidno.9)

下划线所示序列为限制性内切酶xbai酶切识别位点。

2、利用引物ab-1和ab-2从除虫链霉菌ma-4680(atccno：31267)基因组dna上进行pcr扩增得到avebi基因的同源重组左臂片段，长3580bp。

3、用hindiii和xbai双酶切同源重组左臂片段，得到左臂片段1；用hindiii和xbai双酶切pspd1，得到载体片段1；将左臂片段1与载体片段1连接，得到重组质粒，将其命名为puab-1。将puab-1送测序，结果与预期一致。

(二)puab-2的构建

1、合成如下引物：

ab-3:5’-tcgtctagatcaggcagatgcagcgggccacggtcg-3’(seqidno.10)

下划线所示序列为限制性内切酶xbai酶切识别位点；

ab-4:5’-tcaatcgataccgcgcggaacgccgaggagtcgacg-3’(seqidno.11)

下划线所示序列为限制性内切酶clai酶切识别位点。

2、利用引物ab-3和ab-4从除虫链霉菌ma-4680基因组dna上进行pcr扩增得到avebi基因的同源重组右臂片段，长3054bp。

3、用xbai和clai双酶切同源重组右臂片段，得到右臂片段1；用xbai和clai双酶切puab-1，得到载体片段2；将右臂片段1与载体片段2连接，得到重组质粒，将其命名为puab-2。将puab-2送测序，结果与预期一致。

二、基因工程菌dmb-240的构建

(一)利用接合转移的方法将重组质粒puab-2转化到基因工程菌dm-209

将puab-2质粒转化大肠杆菌et12567(puz8002)，在含有50μg/ml氨普霉素、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml氯霉素的lb平板上筛选转化子。将转化子通过接合转移转化到基因工程菌dm-209，涂布ms平板，30℃培养16-20h。将含有0.5mg萘啶酮酸和1.25mg氨普霉素的无菌水覆盖到平板上，30℃继续培养5d以上，长出转化子。

(二)avebi基因失活突变株的筛选及验证

1、将步骤(一)得到的转化子在含20μg/ml萘啶酮酸和25μg/ml氨普霉素的ms平板上传代一次后，在不含抗生素的平板上传代两次，分离单菌落。单菌落分别在含25μg/ml氨普霉素和不含抗生素的ms培养基上培养，筛选出氨普霉素敏感菌株。

2、合成如下引物：

ab-5:5’-gtgtcattcatggttgccgcctcat-3’(seqidno.12)

ab-6:5’-agaaactcatcccgcggttcgtcac-3’(seqidno.13)

3、以出发菌株dm-209的基因组dna为模板，以ab-5和ab-6为引物进行pcr扩增，得到的扩增产物的条带大小为2177bp。以步骤1筛选到的氨普霉素敏感菌株的基因组dna为模板，以ab-5和ab-6为引物进行pcr扩增，得到的扩增产物的条带大小为1039bp，与理论大小一致，并将该菌送测序，结果与预期一致，证明其为同源重组双交换子(avebi基因失活突变株)，将其命名为dmb-240。

三、基因工程菌dmb-240和出发菌株dm-209的发酵

(一)基因工程菌dmb-240的发酵

1、种子液的制备

将培养好的dmb-240孢子用接种铲刮取约1cm²的菌苔转接种子培养基中，在培养温度28℃和250rpm条件下，摇床振荡培养40小时，得到种子液。

其中，种子培养基的配方(g/l)如下：玉米淀粉20，黄豆饼粉10，葡萄糖5g，棉籽饼粉10，余量为水，ph7.2。经121℃灭菌20分钟。

2、发酵液的制备

以6％(体积比)的接种量将步骤1得到的种子液接种于发酵培养基中，在培养温度28℃和250rpm条件下，摇床振荡培养13d，在发酵的第24h，向发酵培养基中加入终浓度为0.8g/100ml的环己甲酸钠。最终得到dmb-240的发酵液。

其中，发酵培养基的配方(g/l)如下：玉米淀粉100，淀粉酶0.2，黄豆饼粉10，棉籽饼粉10，nacl1，k2hpo42，mgso41，caco37，ph7.2。经121℃灭菌20分钟。

(二)出发菌株dm-209的发酵

除将dmb-240替换为dm-209外，重复步骤(一)，得到dm-209的发酵液。

(三)发酵液萃取及hplc分析

分别取步骤(一)得到的dmb-240的发酵液和步骤(二)得到的dm-209的发酵液1ml，加入4ml无水甲醇浸泡，超声1h后，过滤。滤液直接用于hplc分析。

hplc分析条件为：

色谱柱：c18hypersilods24.6×150×5(大连依利特分析仪器有限公司)

流动相：甲醇:乙腈:水＝81:7:12(体积比)

流速：1ml/min

吸收波长：240nm

结果如图1所示。

图1中，a是出发菌株dm-209的发酵液的hplc图谱，b是基因工程菌dmb-240的发酵液的hplc图谱。结果表明，基因工程菌dmb-240的发酵产物中产生了两个明显的新化合物c240-1和c240-2(图中出峰时间分别为2.486min和3.087min)，其发酵产物中没有多拉菌素(dm)组分。

实施例2、十六元大环内酯类化合物的制备及结构鉴定

一、制备方法

将实施例1得到的dmb-240的发酵液用滤布过滤得到滤饼，滤饼用乙醇提取两次，合并得到的乙醇提取液。将乙醇提取液经过真空浓缩至15％的酒精度，再用乙酸乙酯萃取，萃取液真空浓缩至干即得到含有目的化合物的浸膏。该浸膏用硅胶拌样后，上硅胶柱，用体积比为90:10、80:20、70:30、60:40的石油醚/丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱流分，hplc检测，选取含c240-1和c240-2组分的洗脱液，分别真空浓缩至干得含c240-1和c240-2的样品。将该样品进行反向色谱分离，条件如下：

液相系统：agilent1100半制备高压液相色谱仪

色谱柱：zorbaxeclipsexdb-c18(250mm×9.4mm)

洗脱剂：甲醇:乙腈:水＝46:46:8(体积比)

流速：1.5ml/min

检测波长：240nm

收集保留时间为3.320min的峰得到化合物c240-1，收集保留时间为5.210min的峰得到化合物c240-2。

二、结构鉴定

c240-1分子式：c36h52o9，白色粉末；其高分辨质谱(hresi-ms)如图2所示。

化合物c240-2通过hresi-ms、¹h-nmr、¹³c-nmr及二维nmr等波谱分析方法确定了其结构。其物理化学性质如下：

c240-2分子式：c36h50o8，白色粉末；溶解性：易溶于氯仿、丙酮，微溶于甲醇，不溶于水；比旋度：

高分辨质谱(hresi-ms):611.3569，[m+h]⁺(calcdforc36h51o8611.3578)，如图3所示。

紫外吸收光谱(uvabsorptionspectrum)λmax(etoh)nm(logε)：247(3.55)

红外吸收光谱(irabsorptionspectrum)vmaxcm-¹：3489，2928，2855，1695，1647，1452，1380，1285，1097，998

c240-1和c240-2的¹h-nmr(400mhz,cdcl3)和c240-2的¹³c-nmr(100mhz,cdcl3)数据见表1，c240-1和c240-2的¹h-nmr谱图分别如图4和图5所示，c240-2的¹³c-nmr谱图如图6所示。

表1c240-1和c240-2的¹h-nmr(400mhz,cdcl3)和c240-2的¹³c-nmr(100mhz，cdcl3)数据

通过以上数据最终确定，c240-1和c240-2为十六元大环内酯类化合物，其结构通式为式i：

当x-y为ch2-ch(oh)时，为本发明的化合物c240-1，当x-y为ch＝ch时，为本发明的c240-2。

实施例3、化合物c240-1和c240-2对3龄期菜青虫(pierisrepae)的生物活性测定

采用浸渍法，以3龄期菜青虫为试虫，对阿维菌素、化合物c240-1和c240-2进行了生物活性测定，具体步骤如下：

一、分别将阿维菌素、化合物c240-1和c240-2作为供试药剂用丙酮稀释，制成如表2所示的不同浓度的药液。

二、将无任何农药的甘蓝叶片用无菌水清洗干净，晾干，在步骤一配好的不同浓度的阿维菌素、化合物c240-1或c240-2药液内浸5s，取出，放入无菌培养皿(d＝80cm)。挑取大小一致健壮饥饿4h的3龄期菜青虫幼虫放入各组培养皿中，每个培养皿放6只，每个浓度做4皿，重复3次。

另设溶剂对照组(以丙酮作为药剂)以及清水对照组重复该步骤。

三、恒温25℃，恒湿70％～80％下饲养，待各组试虫吃完后再加一片叶碟。观察死亡数，计算死亡率。

不同药剂对菜青虫的毒力见表2。

表2供试药剂对3龄期菜青虫的活性

注：清水对照组的死亡率(％)为0。

表2结果表明，与阿维菌素相比，化合物c240-1和c240-2的效果明显更好，在浓度更低的情况下就可以实现100％杀虫。其中，化合物c240-2对3龄期菜青虫的活性更好。

实施例4、化合物c240-1和c240-2对松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)的生物活性测定

采用浸渍法，以松材线虫为试虫，对阿维菌素、化合物c240-1和c240-2进行了活性测定，具体步骤如下：

一、分别将阿维菌素、化合物c240-1和c240-2作为供试药剂用蒸馏水稀释成有效成分分别为2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、50ppm的药液。

二、将松材线虫悬浮液用水稀释至每90μl含100条左右。移取步骤一制备的不同浓度的药液10μl，分别加入到96孔板内，再加入90μl线虫悬浮液。每个浓度1个处理，重复3次。以蒸馏水为对照(ck)。

三、将96孔板置于25℃的恒温箱中培养。24h后镜检统计线虫的死亡，计算死亡率和lc50值。

不同浓度的药剂对松材线虫的毒力见表3。

表3供试药剂对松材线虫的活性测定

表3结果表明，化合物c240-2对松材线虫的活性较好，与阿维菌素类似，而化合物c240-1活性稍低。

序列表

<110>浙江劢康生物科技有限公司

浙江海正药业股份有限公司

<120>十六元大环内酯类化合物及其制备方法与应用

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gggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagca420

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