本发明涉及一种来源于放线菌(actinobacteria)的转氨酶基因、突变体、工程菌及其在催化合成r-3-氨基丁醇中的应用。
(二)背景技术
r-3-氨基丁醇结构式如下，在有机合成和药物生产中有着广泛的用途。
r-3-氨基丁醇是合成度鲁特韦的重要原料，度鲁特韦是2013年被美国fda批准上市的抗艾滋病整合酶抑制剂，与现有的hiv整合酶抑制剂雷特格韦、埃替格韦相比，该药物的安全性提高，与默沙东的抗hiv/aids药物拉替拉韦相比，度鲁特韦不但在三期临床试验中达到了与其相匹敌的疗效，而且不需要与药物促进剂联合用药，同时具有非常强效的耐药属性。中间体r-3-氨基丁醇品质的好坏以及价格的高低对于度鲁特韦的品质及生产成本有着很重要的影响。另外，r-3-氨基丁醇还能够衍生为β-内酰胺，进而可以合成青霉烯类抗生素。因此，对r-3-氨基丁醇合成的研究具有重要的意义。
目前，文献所报导r-3-氨基丁醇的合成方法主要有以下几种：1、由手性r-3-氨基丁酸酯直接酯还原；该方法虽然步骤少，但是手性r-3-氨基丁酸酯很难得到，而且价格昂贵，对映体过量值不高，还原收率较低。2、以手性(r)-丙氨酸为起始原料，经氨基保护后，以重氮甲烷增长碳链变为β-氨基酸酯，脱保护后还原得到目标产物。该方法的缺点是高手性纯度的(r)-丙氨酸较难得到，重氮甲烷使用危险。3、巴豆酸酯与(r)-(+)-α-苯乙胺反应生成具有两个手性中心的一组差向异构体，通过硅胶柱层析分离后得到单一的异构体，然后经过酯还原、脱苄基得到r-3-氨基丁醇；该路线步骤较少，原料易得，但是还存在以下问题：由于第一步反应选择性较差，得到几乎等量的两个差向异构体，分离纯化比较困难，常采用色谱柱法分离，洗脱剂用量大、损失大、效率低；同时由于使用了价格昂贵的lialh4作为还原剂，原材料成本也显著上升，由于效率与成本原因，柱层析方法不宜规模化工业化生产。
生物催化合成r-3-氨基丁醇具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点，越来越受到关注。此外，利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行分子改造，提高催化剂的活性、立体选择性等催化属性，进一步通过反应体系的优化，推动其工业化生产进程具有重要意义。目前尚没有用生物催化合成的报道，而本发明所涉及的放线菌(actinobacteria)来源转氨酶，于大肠杆菌进行表达、改造后，首次运用于r-3-氨基丁醇的合成应用。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种源自放线菌的转氨酶、突变体及催化合成r-3-氨基丁醇的应用，以丁酮醇为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，催化合成r-3-氨基丁醇(图1)；通过定向进化策略对放线菌来源的转氨酶进行改造，获得突变体蛋白，其酶活提高，对r-3-氨基丁醇的合成能力提高。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种能催化丁酮醇合成r-3-氨基丁醇的源自放线菌(actinobacteria)的转氨酶，所述基因序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。本发明还涉及转氨酶基因构建的重组载体及基因工程菌。
所述转氨酶催化合成r-3-氨基丁醇方法为：以含转氨酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以丁酮醇为底物，以辅酶磷酸吡哆醛为辅因子，以异丙胺或d-丙氨酸为氨基供体，以乙腈或二甲基亚砜为助溶剂，以ph5.0～9.0的缓冲液(优选ph8.0-8.5的tris-hcl缓冲液)为反应介质构成反应体系，在温度20～45℃(优选30℃)条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得r-3-氨基丁醇；反应体系中，底物终浓度为20-500mm(优选50-100mm)，辅因子终浓度0.1-2mm(优选1mm)，氨基供体终浓度为0.04-3m(优选0.1-2m，更优选0.2-0.4m)，，助溶剂体积浓度0.1％-15％(优选5-10％)，催化剂用量以湿菌体重量计为10-100g/l(优选50-100g/l，最优选50g/l)。
第二方面，本发明提供一种源自放线菌(actinobacteria)的转氨酶突变体，所述突变体是将seqidno.2所示氨基酸序列的第80位、294位进行单突变或双突变获得的。
进一步，所述突变体是将seqidno.2所示氨基酸序列的第80位缬氨酸突变为甘氨酸，同时将第294位苏氨酸突变为丝氨酸获得的，所述突变体氨基酸序列为seqidno.4所示。
本发明涉及一种所述的转氨酶突变体编码基因，所述编码基因核苷酸序列为seqidno.3所示。
本发明针对放线菌(actinobacteria)来源的转氨酶序列，进行人工设计、合成，成功克隆于大肠杆菌后进行了该基因的表达。进一步从大肠杆菌中提取含转氨酶基因的质粒，使用易错pcr的方法对转氨酶的核苷酸序列进行改变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过筛选获得活力提高的突变体，以便能够提高其对于丁酮醇的催化活力。
本发明可通过本领域常规方法将本发明的转氨酶及其突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pet-28b。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将获得的野生型转氨酶及突变体基因产物与载体pet-28b连接，构建本发明的转氨酶突变基因重组表达质粒pet28b-ta0和pet28b-ta1。
引入编码本发明的转氨酶及其突变体的dna的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的转氨酶突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌e.colibl21(de3)。将重组质粒pet28b-ta0和pet28b-ta1转化至e.colibl21(de3)中，获得工程菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0和e.colibl21(de3)/pet28b-ta1。
本发明重组转氨酶及其突变体的制备包括培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组转氨酶突变蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的转氨酶的培养基，优选lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生菌体即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组e.colibl21(de3)/pet28b-ta0和e.colibl21(de3)/pet28b-ta1接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养至光密度od600达到0.4～1(优选0.4)时，在终浓度为0.1～1.0mm(优选1.0mm)异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)的诱导下，即可高效表达本发明的转氨酶及其突变蛋白。
第三方面，本发明利用转氨酶突变体合成r-3-氨基丁醇的方法为：以含转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以丁酮醇为底物，以辅酶磷酸吡哆醛(plp)为辅因子，以异丙胺或d-丙氨酸为氨基供体，以乙腈或二甲基亚砜为助溶剂，以ph5.0～9.0(优选8.0-8.5)的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度20～45℃(优选30℃)条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得r-3-氨基丁醇。
进一步，反应体系中，底物终浓度为20-500mm(优选50-100mm)，辅因子终浓度0.1-2mm(优选0.5-1.2mm，更1mm)，氨基供体终浓度为0.04-3m(优选0.15-2m，更优选0.2-0.4m)，助溶剂体积浓度0.1％-15％(优选5-10％)，催化剂用量以湿菌体重量计为10-100g/l(优选50g/l)。
进一步，所述缓冲液为50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：
1)斜面培养：将含转氨酶突变体编码基因的重组菌基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述lb培养基质量终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，ph7.0；
2)种子培养：将斜面菌体接种至含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述lb液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0；
3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，置于37℃下培养至od600值为0.4，加入终浓度0.1mm异丙基-β-d-半乳糖苷或终浓度15g/l乳糖，置于28℃继续培养12h，离心，收集湿菌体。
与现有技术相比，本发明提供的r-3-氨基丁醇的生物制备方法，初始原料为丁酮醇，价格便宜。所需的重组转氨酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和酶加入后开始反应，直接得到终产物r-3-氨基丁醇，工业成本低。本发明所提供的放线菌转氨酶突变体与野生型相比较，具有更优良的催化活性。在最优体系下，对100mm底物的转化率达90％，ee值达到99.9％；对500mm底物的转化率达到78％，ee值达到99.9％，与野生型相比较，对底物转化率分别提高了12％-25％。
(四)附图说明
图1是本发明r-3-氨基丁醇的生物制备方法的反应原理图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1含转氨酶基因工程菌的构建
选择来源于放线菌(actinobacteriasp)的转氨酶基因(核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示)进行全基因合成，与质粒pet-28b连接，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培养过夜后，挑取阳性转化子并鉴定测序。将所验证的阳性单克隆接种至5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，经再次验证后，将重组表达载体转入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，获得重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0(即为亲本菌株)，于37℃在含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板上培养过夜。挑取单克隆接种至5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜后，于4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，-80℃甘油贮存备用。
实施例2转氨酶突变体的获得及含突变体基因工程菌的构建
1、突变文库的构建
以实施例1获得的重组表达载体pet28b-ta0为模板，通过易错pcr扩增，获得突变序列。扩增引物为(5’gctgaggatccatgaccatctctaaagacat3’)和(5’gcatcaagctttcagtattcgatagcttc3’)。
扩增体系为：50μl反应体系：10xtaqpolymerasebuffer：5μl；mg2+(25mm)：2-8μl；mm2+(25mm):2-8μl；10mmdntpmixture(datp、dctp、dgtp和dttp各2.5mm)4μl；浓度为50μm的上游引物、下游引物各1μl，dna模板：1μl；taqdna聚合酶：10u；用双蒸水补足体系。
pcr反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析和切胶回收，由bamhi/hindiii进行双酶切，与同样进行酶切处理的pet28b连接，连接液电击转化e.colibl21(de3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培养过夜，得到转氨酶的突变文库。
2、阳性突变体的筛选
从突变文库中挑取单克隆，接种至96孔板1ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.1mm异丙基-β-d-半乳糖苷，置于28℃继续培养12h，离心，收集湿菌体，进行催化合成r-3-氨基丁醇的研究。反应体系为1ml，含20mm底物、体积浓度为2％的助溶剂dmso、终浓度为1mm的辅因子plp、终浓度为80mm的氨基供体。反应2h后，取样进行气相色谱测定底物转化率，筛选获得活力提高的阳性克隆(重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1，即为突变菌株)，经过测序分析，所获得突变体为双突变体v80g/t294s(即将seqidno.2氨基酸序列第80位缬氨酸突变为甘氨酸，同时将第294位苏氨酸突变为丝氨酸)，其氨基酸序列如seqidno.4所示，核苷酸序列如seqidno.3所示。该突变体重组细胞催化合成r-3-氨基丁醇的酶活达到592u/g，与野生型相比，提高了35％。
所述菌体酶活的定义为：在上述反应条件下，每小时催化1μmol底物丁酮醇转化为r-3-氨基丁醇所需的酶量为一个酶活单位，用u表示。
实施例3转氨酶野生型及突变体催化剂的制备
1)斜面培养：将含转氨酶野生型基因和转氨酶突变体基因的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1分别接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述lb培养基质量终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，ph7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。
2)种子培养：将斜面菌体接种至含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述lb液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。
3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，置于37℃下培养至od600值为0.4，加入终浓度0.1mm异丙基-β-d-半乳糖苷或终浓度15g/l乳糖，置于28℃继续培养12h，离心，收集湿菌体后，储存与-20℃备用。所述lb液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。
实施例4转氨酶及突变体催化合成r-3-氨基丁醇
1)在反应介质中依次加入终浓度为50mm的底物、体积浓度为5％的助溶剂、终浓度为0.5mm的辅因子、终浓度为150mm的氨基供体和30g/l催化剂组成反应体系；将该反应体系在30℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相色谱法检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，结果亲本菌株细胞(重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0)催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率81％左右；突变体菌株细胞(重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1)催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率91％左右。
所述底物为丁酮醇；所述助溶剂为乙腈；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为d-丙氨酸，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体，所述反应介质为ph为8.0的100mm的碳酸氢盐缓冲液。
2)在反应介质中依次加入终浓度为50mm的底物、体积浓度为8％的助溶剂、终浓度为1mm的辅因子、终浓度为200mm的氨基供体和50g/l催化剂组成反应体系；将该反应体系在28℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相色谱法检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，测得亲本菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率85％左右；突变体菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率96％左右。
所述底物为丁酮醇；所述的反应介质为ph为8.5的50mm的tris缓冲液；所述助溶剂为二甲基亚砜；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为d-丙氨酸，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体。
3)在反应介质中依次加入终浓度为100mm的底物、体积浓度为10％的助溶剂、终浓度为1mm的辅因子、终浓度为400mm的氨基供体和50g/l催化剂组成的反应体系；将该反应体系在25℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相进行检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，亲本菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率80％左右；而突变体菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率90％左右。
所述底物为丁酮醇；所述的反应溶液为ph为7.8的80mm的碳酸氢盐缓冲液；所述助溶剂为乙腈；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体。
4)在反应介质中依次加入终浓度为200mm的底物、体积浓度为10％的助溶剂、终浓度为1mm的辅因子、终浓度为1m的氨基供体和80g/l催化剂组成反应体系；将该反应体系在35℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相色谱法检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，亲本菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率77％左右；而突变体菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率86％左右。
所述底物为丁酮醇；所述的反应溶液为ph为8.5的50mm的tris缓冲液；所述助溶剂为乙腈；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为d-丙氨酸，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体。
5)在反应介质中依次加入终浓度为400mm的底物、体积浓度为10％的助溶剂、终浓度为1.2mm的辅因子、终浓度为1.6m的氨基供体和80g/l催化剂组成反应体系；将该反应体系在30℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相色谱法检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，亲本菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率61％左右；而突变体菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率78％左右。
所述底物为丁酮醇；所述的反应溶液为ph为7.5的90mm的tris缓冲液；所述助溶剂为二甲基亚砜；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体。
6)在反应介质中依次加入终浓度为500mm的底物、体积浓度为15％的助溶剂、终浓度为1mm的辅因子、终浓度为2m的氨基供体和100g/l催化剂组成反应体系；将该反应体系在28℃的条件下反应24h；反应过程中，取样采用高效气相色谱法检测样品中的r-3-氨基丁醇的生成量，亲本菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率58％左右；而突变体菌株细胞催化合成r-3-氨基丁醇光学纯度99％、转化率72％左右。
所述底物为丁酮醇；所述的反应溶液为ph为8.0的100mm的碳酸氢盐缓冲液；所述助溶剂为二甲基亚砜；所述辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为d-丙氨酸，所述催化剂为实施例3制备的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta0湿菌体和重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-ta1湿菌体。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。
序列表
<110>浙江工业大学
<120>一种源自放线菌的转氨酶、突变体、重组菌及应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1026
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>1
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gctatccgtgaaccgaccccggctggttctgttatccagtactctgactacgaactggac120
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<212>prt
<213>未知(unknown)
<400>2
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