本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种基因工程细胞和利用该基因工程细胞进行体外高效扩增nk细胞的方法。
背景技术
最新版的《世界癌症报告》对全球180多个国家的28种癌症的总体情况和流行趋势进行了全面的描述和分析，报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。其中，肺癌、胃癌、肝癌为发病率最高的癌症，而乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌使女性健康受到威胁。
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(t细胞、nk细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。
nk细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫细胞，无需有抗体存在或者预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。nk细胞表达cd56但缺失cd3，通常用cd3-cd56+来标志和定义nk细胞。nk细胞对于不同来源的肿瘤细胞都具有很强的杀伤作用，在肿瘤的免疫细胞治疗方面有着良好的发展和应用前景。nk细胞在外周血中约占淋巴细胞的5％-10％，所占比例很少。如何获得足够数量的高杀伤性的nk细胞是nk细胞应用于临床的重要保证。外周血中分离出来的高纯度的nk细胞数量有限且增殖能力弱，在体外不给予其它影响因素的情况下，nk细胞增殖的效率和杀伤功能低下。
目前，体外促进nk细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将k562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激nk细胞的生长。上述方法虽然能够刺激nk细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对nk细胞培养造成不确定性以及不安全性。
因此，进一步开发一种能高效扩增且保证nk细胞增殖速度和肿瘤细胞杀伤效果的nk细胞方法十分必要。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基因工程细胞及体外高效扩增nk细胞的方法，该基因工程细胞能同时高表达il-15、il-18和4-1bbl；采用本发明的方法不仅可以高效地扩增人nk细胞，而且还可以增强nk细胞的杀伤力。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提出一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞，该基因工程细胞能跨膜稳定表达il-15、il-18和4-1bbl。
本发明的第二个目的在于提出一种上述基因工程细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别构建重组il-15表达转座子、重组il-18表达转座子和重组4-1bbl表达转座子；
(2)重组il-15表达转座子与转座酶共转染k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15跨膜稳定表达的il-15-k562细胞；
(3)重组il-18表达转座子与转座酶共转染il-15-k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15、il-18跨膜稳定表达的il-15-il-18-k562细胞；
(4)4-1bbl表达转座子与转座酶共转染il-15-il-18-k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15、il-18和4-1bbl跨膜稳定表达的il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞。
进一步地，所述步骤(1)中分别使用piggybac转座子系统构建重组il-15表达转座子、重组il-18表达转座子和重组4-1bbl表达转座子；具体方法是：分别pcr扩增il-15、il-18和4-1bbl基因，然后分别将扩增产物插入piggybac睡美人表达载体的xbai-bamhi位点，分别构建对应的重组il-15表达转座子、重组il-18表达转座子和重组4-1bbl表达转座子，其中il-15，il18带有cd8tm跨膜区。
更进一步地，所述piggybac睡美人表达载体中含有人自身的ef1α启动子和选择标记基因。
本发明的第三个目的在于提出上述基因工程细胞的应用，所述基因工程细胞应用于体外扩增nk细胞。
本发明的第四个目的在于提出一种基于上述基因工程细胞的体外高效扩增nk细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建能跨膜稳定表达il-15、il-18和4-1bbl的基因工程细胞il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞；
(2)丝裂霉素c处理步骤(1)获得的il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞后，用nk细胞扩增培养液洗涤细胞若干次后，用含有10％自体血浆的nk细胞扩增培养液重悬细胞，制作成细胞悬液备用；
(3)将步骤(2)中的灭活il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞悬液与pbmc细胞混合，在nk细胞扩增培养液中共培育；
(4)根据细胞状态及培养基颜色变化，2～3天进行半换液，以获得足够量的nk细胞。
进一步地，所述il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞是通过以下步骤制备的：
(1)分别构建重组il-15表达转座子、重组il-18表达转座子和重组4-1bbl表达转座子；
(2)重组il-15表达转座子与转座酶共转染k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15跨膜稳定表达的il-15-k562细胞；
(3)重组il-18表达转座子与转座酶共转染il-15-k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15、il-18跨膜稳定表达的il-15-il-18-k562细胞；
(4)4-1bbl表达转座子与转座酶共转染il-15-il-18-k562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得il-15、il-18和4-1bbl跨膜稳定表达的il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞。
进一步地，所述步骤(2)中丝裂霉素c处理il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞的具体方法为：每1×107个il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞加入60μl丝裂霉素c，混匀，37℃水浴2h；所述丝裂霉素c的浓度为500μg/ml，所述il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞加入丝裂霉素c后终浓度为30μg/ml。
进一步地，步骤(3)的nk细胞扩增培养液中l-15-il-18-4-1bbl-k562细胞和pmbcs细胞密度均为1×106/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明基于分子生物学和细胞培养领域，利用piggybac转座子系统构建跨膜稳定表达il-15、il-18和4-1bbl的k562工程化细胞及细胞体外刺激技术，提供一种k562细胞扩增激活nk细胞的方法。il15和il-18因其对nk细胞的发育与增殖有重要的调控作用，而被广泛用于nk细胞的扩增与培养当中。与以往的人工抗原提呈细胞相比，本发明联合使用il-15、il-18两个细胞因子跨膜表达，结合4-1bbl共同构建k562滋养层细胞，细胞膜上表达的il-15和il-18比可溶状态下的il-15、il18刺激nk细胞增殖的效果更好，nk细胞更容易捕获膜表面表达的il-15、il-18细胞因子。
(2)使用piggybac转座子系统，制备工艺相对简单，可塑性高，通过与其他功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域等，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，最重要的是可以提高外源基因转座的靶向性。
(3)本发明通过基因工程的方法，构建基因修饰的k562工程细胞，该基因工程细胞能同时高表达il-15、il-18和4-1bbl；采用本发明的方法不仅可以高效地扩增人nk细胞，而且还可以增强nk细胞的杀伤力。
(4)本发明的nk细胞扩增方法操作简单、成本低，扩增的nk细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于nk细胞大规模制作，为nk细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。
附图说明
图1是本发明构建pb-ef1-il-15tm-puro质粒转座子图谱。
图2是本发明构建pb-ef1-il18tm-puro质粒转座子图谱。
图3是本发明构建pb-ef1-4-1bbl-puro质粒转座子图谱。
图4是nk细胞杀伤活性的测定结果。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：基因工程细胞il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞的制备
(1)分别将il-15、il-18、4-1bbl基因通过pcr扩增，然后将各自的扩增产物分别插入piggybac睡美人表达载体的xbaibamhi位点，分别构建pb-ef1-il-15tm-puro、pb-ef1-il18tm-puro、pb-ef1-4-1bbl-puro转座子。
(2)将pb-ef1-il-15tm-puro转座子与转座酶transposase共转染k562细胞，并培养转染后的k562细胞；用流式细胞仪分选，获得il-15跨膜稳定表达的k562细胞(il-15-k562细胞)。
(3)将pb-ef1-il-18tm-puro转座子与转座酶transposase共转染il-15-k562细胞，并培养转染后的k562细胞；用流式细胞仪分选，获得il-15、il-18跨膜稳定表达的k562细胞(il-15-il-18-k562细胞)。
(4)将pb-ef1-4-1bbl-puro转座子与转座酶transposase共转染il-15-il-18-k562细胞，并培养转染后的k562细胞；用流式细胞仪分选，最终获得il-15、il-18、4-1bbl跨膜稳定表达的k562细胞(il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞)。
实施例2：nk细胞的体外高效扩增
1、pbmc细胞制备
用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；将抗凝血缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(ficoll)的50ml离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心；离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50ml离心管中，加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入pbs，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入pbs，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到pbmc细胞。
2、nk细胞的扩增培养
(1)将实施例1中制备的il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞按每1×107个k562工程细胞加入60μl500μg/ml丝裂霉素c，混匀，37℃水浴2h，用1640培养基洗涤细胞5次后，用含有10％自体血浆的1640培养液重悬细胞，制作成细胞悬液备用。
将收集到的pbmc细胞与步骤(1)中的细胞悬液按细胞比例1：1比例混合，按pbmc细胞和il-15-il-18-4-1bbl-k562细胞均为1×106的密度接种于培养瓶中，培养瓶中培养液为1640培养基，添加总体积10％的自体血浆。
为了比较本发明的方法和已有方法，实验中设置对照组，用于对照的常规制备方法如下：使用抗人单抗cd16包被培养板，4度冰箱平放过夜。次日把同批次pbmc细胞悬液加入到培养瓶中，培养基与本发明所使用的培养基完全一样，培养过程中另加入1000u/mlil-2、100u/mlil-15、100u/mlil-18和100u/mlil-12。
(3)每隔2-3天观察培养基颜色变化，并进行半换液，补液前细胞密度不大于1×106/ml，换液后细胞密度在0.5-1×106/ml。对照组同时补足相应细胞因子。
(4)分别在第0、7、14及21天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较常规培养方法与本发明方法的两组细胞的扩增情况。培养第21天的时候，取细胞用于流式细胞仪分析细胞纯度。结果如表1所示，可以看出本发明扩增nk细胞的能力明显优于对照组的，纯度更高。
表1
注：donor1、donor2、donor3为不同志愿者，实验组和对照组的增殖倍数、纯度之间均有显著差异，p<0.01。
实施例3：nk细胞杀伤活性的测定
采用4hldh释放测定法，检测nk细胞对人白血病细胞k562的杀伤效果。
1、取传代细胞株k562细胞进行计数，制成1×105cells/ml细胞悬液，加入96孔板，每孔50μl。
2、将培养的nk细胞分别按照效：靶为1：1、10：1、20：1、40：1加入96孔板中，同时设效应细胞和靶细胞自然释放孔，培养基自然释放孔，靶细胞最大释放孔，体积矫正对照，每孔体积100μl，均设3个复孔，250g离心4min，置于37℃，5％co2、95％饱和湿度的培养箱中孵育4h。
3、在反应结束前45min靶细胞最大释放孔每孔加入10μl裂解液。反应结束后，每孔吸取50μl上清和50μlldh酶反应液置于另一新的96孔板，室温避光反应30min，加入反应终止液50μl，酶标仪测其od值。
4、计算自然杀伤活性。公式为：自然杀伤活性％＝(测定管od值-靶细胞自然释放管od值-效应细胞自然释放管od值)/(靶细胞最大释放管od值-靶细胞自然释放管od值)×100％。
从图4可以看出，在不同效靶比条件下，本发明所得的nk细胞的杀伤能力均明显的高于常规方法所得nk细胞的杀伤能力。效靶比越高，nk细胞的杀伤效率越高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。