贝莱斯芽孢杆菌菌株HN03及其应用的制作方法

本发明涉及一株新的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

土传病害是由生活在土壤中或残留在土壤的病株残体中的病菌引起的作物病害。土传病在世界范围内非常普遍，通常引起作物枯萎病、立枯病、黄萎病、根腐病、青枯病、根结线虫病和疫病等，这些病害给农业生产带来重大的经济损失，严重制约现代农业的可持续发展。

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型[fusariumoxysporumf.sp.cubense(e.f.smith)snyder&hansen)引起的一种重要的土传真菌性病害。香蕉作为全球第四大食物贸易商品，且该病对香蕉产业的危害具有世界性、毁灭性等特征，使其成为全球最重要的植物病害之一。从1874年首次报道至今，尽管有多种防治方法的研究，但仍未找到对香蕉实际生产种植过程中，香蕉枯萎病的发生、防控有效的手段。

传统的化学防治方法通常使用化学农药直接喷施继而作用到作物或病原菌。但该方法难以触杀到隐藏在土中及香蕉维管束内部的香蕉枯萎病菌，用溴化甲烷进行土壤熏蒸消毒最长只能维持3年，香蕉枯萎病菌又卷土重来，并且化学药品的施用不仅因病原菌易产生抗性而药效变得更低，也易引起一系列的环境和安全问题，故该防治方法不被推荐来继续研究和使用。抗病品种的选育周期长，目前进展非常缓慢，虽有选育出抗性品种，但其栽培性状出现果实口感差、品质不佳等问题，影响其推广。生物防治手段对环境、人体较为友好，被广大研究者推崇。但目前生物防治尤其是利用拮抗菌，存在着菌株在环境中难存活，难以持续对抗土壤中病原菌，或难以定殖于植物对抗病原菌等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株新的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03，保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03bacillusvelezensishn03，分类命名为bacillusvelezensishn03，保藏编号为cctccm2018084。

一种微生物制剂，包括载体，载体负载有上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03。

上述贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03在制备微生物病害生物防治菌剂中的应用。

作为上述应用的进一步改进，微生物病害病原菌选自香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病1号生理小种、辣椒枯萎病菌、番茄枯萎病菌、烟草疫霉病菌、葡萄炭疽病菌、诺丽枯萎病菌、释迦枯萎病菌、苜蓿枯萎病菌。

一种香蕉育种栽培基质，包括有机质和上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03，有机质选自蚯蚓粪和牛粪中的至少一种。

作为上述香蕉育种栽培基质的进一步改进，基质还含有河沙、椰糠。

作为上述香蕉育种栽培基质的进一步改进，贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03初始菌剂、蚯蚓粪的质量比为1：(8～12)。

作为上述香蕉育种栽培基质的进一步改进，贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03初始菌剂、蚯蚓粪、河沙、椰糠的质量比为0.1:1:2:86.9。

作为上述香蕉育种栽培基质的进一步改进，贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03初始菌剂的培养方法为：

1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03接种于na培养基30℃培养24h后得到发酵种子液；

2)将发酵种子液按1％体积比接种于na培养基中，30℃、200rpm震荡培养3-5d，得到菌株发酵液；

3)将菌株发酵液离心后，菌体重悬浮于清水中，得到菌株初始菌剂。

作为上述香蕉育种栽培基质的进一步改进，菌株初始菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的菌液浓度不低于10⁹cfu/ml。

本发明的有益效果是：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03对香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及其他多种病原菌都有很好的抑制作用。

将本发明中的贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03菌体(不含发酵液)与蚯蚓粪一起制成生物有机肥，对香蕉枯萎病1号、4号生理小种及其他多种病原菌具有很好的拮抗效果，同时还对植株生长具有促生作用。

将本发明中的贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03菌体、蚯蚓粪和椰糠一起制成香蕉育种栽培基质，预防苗期枯萎病的侵染，促进香蕉生长，提高蕉苗的抗性。

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03在蚯蚓粪中易于定殖，使其能够在土壤中有效持续抑制香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及其它土壤常见病原的生长，环境安全性好，对多种土传病害均有拮抗作用。

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03菌株培养条件简单，繁殖速度快。仅用菌体而非发酵液作为防控的主体，利于对病原菌的识别并分泌抗性物质。同时菌体较发酵液等易于保存，易于工业化生产、保存、运输。施用可随日常浇水同时进行，施用简单，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的系统发育树；

图2是贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03菌液对峙部分病原菌的实验结果；

图3～9是不同处理组对香蕉枯萎病的防治效果。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的筛选：

发明人从土壤中分离得到贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03，该菌株于2018年2月5日送去中国典型培养物保藏中心进行保藏后，经鉴定该菌株hn03的保藏名称为bacillusvelezensishn03，分类命名为bacillusvelezensishn03，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年2月5日，保藏号为cctccm2018084。保藏中心于2018年3月1日完成检测，确定保藏的微生物存活。

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的鉴定：

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的主要生物学特性为:该菌为革兰氏阳性菌，培养条件为na培养基，30℃，ph7.0。其16srna序列如下(seqidno：1)：

atgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaag(seqidno：1)。

将序列在线提交到ezbiocloud上进行identify比对，发现其与多种芽孢杆菌相似度都达到99％，通过构建系统发育树(图1)，并比对生理生化鉴定后，与bacillusvelezensisfzb42(t)(nr075005.1)生理生化特性相似最高，最终通过dna-dna杂交鉴定与bacillusvelezensisfzb42杂交率大于90％，综合以上最终确定，该菌为bacillusvelezensis。

表1、菌株hn03与部分相似菌株生理生化指标对比

说明：菌株:1,bacillusamyloliquefaciensdsm7；2,bacillusvelezensisfzb42t；3,bacillusvelezensiscr-502；4,bacillusmethylotrophicuscbmb205；5,bacillussiamensiskctc13613＝bacillussiamensisstrainpd-a10t＝bacillusvanilleaxy18；6,hn03。注：+:阳性反应；一：阴性反应；w:弱阳性反应；ng：未检测。

表2、菌株hn03部分碳源利用情况

注:+:阳性反应；一:阴性反应；w:弱阳性反应

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03(bacillusvelezensishn03)及其菌剂对病原菌的抑制作用

贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03菌液对部分病原菌的抑制率

1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03划线30℃培养箱培养24h后，分别用接种环点取单菌落加入50ml的液体na培养基中，30℃摇床200rpm培养24h后，制成母液；

2)在50ml的液体na培养基中，加入1％体积比的母液，30℃摇床200rpm培养72h，制成发酵液；

3)7000r/min离心后，重悬浮于50ml无菌水中，摇匀，制成菌液。

4)待测病原菌在28℃培养箱中培养48小时后，在马铃薯葡萄糖培养基平板中央接入直径为5mm的待测病原菌菌丝块，在距离菌丝块四周2.5cm处，分别接种待测拮抗菌新鲜菌液0.2μl，稍晾干，置于28℃培养箱培养，每处理重复3次，以只接种病原菌为对照，待对照刚长满培养皿时，测量并计算拮抗菌株对病原菌的抑制率。

抑菌率计算公式如下：

抑菌率(％)＝(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100％

实验结果如图2和表3所示。图2中，菌株编号1：香蕉枯萎病菌4号生理小种(海南)；2：香蕉枯萎病菌4号生理小种(越南)；3：香蕉枯萎病菌1号生理小种(海南)；4：诺丽枯萎病菌；5：释迦枯萎病菌；6：番茄枯萎病菌；7：甜瓜枯萎病菌；8：西瓜枯萎病菌；9：烟草疫霉病菌；10：葡萄炭疽病菌；11：苜蓿枯萎病菌；12：释迦枯萎病菌(临高)。

表3、0.2μlhn03菌液对部分病原菌的抑制率

实验结果表明贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03的菌液对多种病原菌具有较好的抑制作用。

盆栽试验检测hn03菌株对香蕉枯萎病的防治效果：

温室的条件控制为温度28℃-30℃，湿度为80％-90％，自然光照，选取长势一致的香蕉苗，营养钵装1kg/钵，将香蕉苗栽入其中。试验设7个处理：

处理1：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡清水30min，种入装有1kg的砖红壤的花盆中。浇500ml清水定根，并每7d浇一次清水。

处理2：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的砖红壤的花盆中。浇500ml清水定根，并每7d浇一次清水。每处理8株。

处理3：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的砖红壤的花盆中。用清水稀释50倍的hn03初始菌剂后，浇灌500ml稀释液定根，并每7d浇一次500ml用清水稀释50倍的hn03初始菌剂。每处理8株。

处理4：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的砖红壤的花盆中。其中砖红壤处理方法为：取10ml初始菌剂稀释5倍后用牛粪100g拌匀，而后拌入砖红壤中。将植株入后浇450ml用清水定根，并每7d浇一次500ml用清水稀释50倍的hn03初始菌剂。每处理8株。

处理5：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的砖红壤的花盆中。其中砖红壤处理方法为：取50ml清水用牛粪100g拌匀，而后拌入砖红壤中。将植株入后浇450ml用清水定根，并每7d浇一次500ml清水。每处理8株。

处理6：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的砖红壤的花盆中。其中砖红壤处理方法为：取10ml初始菌剂稀释5倍后用蚯蚓粪100g拌匀，而后拌入砖红壤中。将植株入后浇450ml用清水定根，并每7d浇一次500ml用清水稀释50倍的hn03初始菌剂。每处理8株。

处理7：用伤根浸渍法剪伤香蕉根部，浸泡foc4菌液(孢子浓度调节为5×10⁵cfu/ml)30min，种入装有1kg的加入生防菌剂的砖红壤的花盆中。其中砖红壤处理方法为：取50ml清水用蚯蚓粪100g拌匀，而后拌入砖红壤中。将植株入后浇450ml用清水定根，并每7d浇一次500ml清水。每处理8株。

病原菌处理方法为：

将foc4在pda平板上活化培养5d，采用无菌水冲洗的方法洗出病原菌孢子，制成孢子悬浮液，镜检并将孢子悬浮液稀释为5×10⁵cfu/ml浓度。试验期间，各处理其他管理措施一致。

在香蕉移栽第90d时，记录各处理每株香蕉黄化叶片和正常叶片数并计算病情指数等级。

香蕉病情指数及防病效果按照以下公式进行计算:

病情指数＝∑(病害的级别×该级别的植株数)/供试植株

病情分级：0级为无症状；1级为整株叶片只有最下部1片叶片发黄轻度萎蔫；2级为1-2片叶片变黄萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片变黄萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片变黄萎蔫；5级为全株3/4以上叶片变黄萎蔫或整株死亡。

实验结果如图3～9及表4所示。其中，图3～9分别为处理1～7的香蕉叶面情况。

表4、bacillusvelezensishn03及其菌剂对盆栽香蕉苗枯萎病的防治效果

由实验结果可知，加了bacillusvelezensishn03的处理的相对防效：处理322.22％、处理481.48％、处理688.89％的相对防效均比其相应对照(未加bacillusvelezensishn03)的处理相对防效：处理20.00％、处理544.44％、处理774.07％高。其中处理6即加了bacillusvelezensishn03菌剂(蚯蚓粪)的处理的发病率最低，相对防效最高。

含bacillusvelezensishn03菌株的香蕉育种栽培基质对盆栽香蕉苗期的促生作用

盆栽试验检测含bacillusvelezensishn03菌株的香蕉育种栽培基质对盆栽香蕉苗期的促生效果，温室的条件控制为温度28℃～30℃，湿度为80％，用遮阴网避免阳光直射，挑取沙床培育中长势一致的香蕉苗，营养钵约10cm×10cm，将香蕉苗栽入其中。试验设3个处理：

处理1：河沙、椰糠总重量比为1:49。

处理2：蚯蚓粪、河沙、椰糠总重量比为0.1:1:49.9。

处理3：bacillusvelezensishn03、蚯蚓粪、河沙、椰糠总重量比为0.1:1:2:86.9。每处理9株。

在正常栽培的情况下，栽培30d后测量香蕉的生长值：茎高、茎粗、鲜重。

表5、bacillusvelezensishn03栽培基质栽培对盆栽香蕉苗期的促生作用

经测定，处理3的茎高、茎粗及鲜重的平均值均高于处理1及处理2。说明含bacillusvelezensishn03栽培基质对香蕉苗生长具有良好的生长促进作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>贝莱斯芽孢杆菌菌株hn03及其应用

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<213>贝莱斯芽孢杆菌

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