耐受重金属的杨树内生肠杆菌YG-14的制作方法

本发明属于环境治理领域，涉及一种肠杆菌的发现和特性，尤其涉及一种耐受重金属的肠杆菌的发现和特性。

背景技术

近年来，我国重金属污染事件频发，对经济社会发展、生态环境建设、食品安全与国民健康等构成严重威胁。2014年公布的全国土壤污染状况调查结果显示，全国土壤总的点位超标率为16.1％，以无机型为主，占全部超标点位的82.8％，主要是镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌以及镍等8种无机污染物。湖南是有色金属之乡，受铅、镉、汞以及砷等重金属污染的土地面积达28000平方公里，占全省总面积的13％，污染矿山土地达260万亩，受污染土壤量大面广，面临着“控增量、化存量”的双重艰巨任务。特别是湖南“镉大米”、“血铅”、“砷中毒”等重金属污染事件，给全省经济社会发展敲响了警钟，重金属污染治理已然是湖南乃至全国的重大环境治理工程和民生工程。

目前，重金属污染修复,主要采取物理修复、化学修复和生物修复三大技术。其中生物修复具有操作简单、费用低、生态效益明显等优点，被誉为“绿色修复技术”而得到广泛认可。微生物修复作为近年来热门的一种生物修复技术，利用土著微生物或人工驯化的具有特定功能的微生物，在适宜环境条件下，通过微生物自身的代谢作用，降低环境中有害污染物活性或将其降解成无害物质。细菌是微生物中数量最多的一类，其个体小、分布广泛、资源丰富、繁殖迅速、代谢旺盛，在修复重金属污染方面潜力很大。而植物内生细菌作为一种新的资源，具有普遍存在性和功能多样性，将其应用于土壤重金属修复，具有对土壤肥力和代谢活性负面影响小的优势，可以避免因污染物转移而对人类健康和环境产生影响。而且，因其独特的生长环境，植物内生细菌与其宿主植物存在和谐的共生关系，能与植物联合修复，缓解重金属对植物的毒害，修复效率高。所以，从重金属污染区的植物中寻找重金属耐受性强的内生细菌具有极大的目的性和选择性，但目前该类内生菌的报道很少。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一株来源于植物，对环境不具外源污染破坏性，对南方典型重金属铅、锌、镉都具有高耐受水平和高去除效率的肠杆菌，为微生物治理重金属污染提供新的资源。

作为优选，本发明所得的一株耐受重金属的内生细菌，是从郴州铅锌尾矿种植的杨树根部分离获得的植物内生菌，结合菌落菌体形态特征和基于细菌16srrna基因序列的系统发育分析，鉴定为肠杆菌enterobactersp.yg-14，该菌株已于2017年12月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)生物保藏，保藏号为：cgmccno.15107。

作为优选，本发明所提供的耐受重金属的内生肠杆菌yg-14能耐受铅、锌以及镉。

作为优选，本发明所提供的肠杆菌yg-14的重金属pb²⁺的最小抑菌浓度是2000mg/l或9.65mm；

作为优选，本发明所提供的肠杆菌yg-14的重金属zn²⁺的最小抑菌浓度是600mg/l或9.18mm；

作为优选，本发明所提供的肠杆菌yg-14的重金属cd²⁺的最小抑菌浓度是1000mg/l或8.90mm。

一种基于上述耐受重金属的杨树内生肠杆菌yg-14的筛选方法。

一种基于本发明所述耐受重金属的肠杆菌yg-14在治理重金属污染时的特性，为去除水体中金属锌、镉时的效果。

一种基于本发明所述耐受重金属的肠杆菌yg-14在治理重金属污染时的特性，为与生物炭复合去除水体中金属铅时的效果。

本发明的优点是：

本发明提供了一种耐受重金属的植物内生肠杆菌enterobactersp.yg-14。从我国湖南郴州的重金属尾矿区的修复树木中分离纯化植物内生细菌，通过对耐受多种重金属的菌株进行筛选，获得一株高耐受铅、锌、镉的植物内生肠杆菌yg-14。发明针对植物内生菌，建立了有效的从树木体内获得耐受重金属菌株的筛选方法，并能对筛选出的菌株进行耐受水平和效果的评价，得到对南方典型重金属铅、锌、镉都具有高耐受水平和去除效果的菌株。

本发明提供了上述菌株yg-14在去除水体中镉、锌污染的效果，并提供了菌株与生物炭复合，去除水体中铅离子污染的效果。高效的去除重金属能力，为微生物治理重金属污染提供了新的技术。

重点在保护该杨树内生肠杆菌enterobactersp.yg-14及其耐受高水平铅、锌、镉的特性，以及该菌株在水体中去除重金属镉、锌、铅的良好效果水平。菌株能同时耐受铅、锌、镉3种重金属，且在水体中去除镉、锌、铅的效果较已有报道具有优势。

附图说明

图1是本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14的进化树；

图2是本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14在水溶液中对100mg·l^-1cd²⁺去除率的曲线图；

图3是本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14在水溶液中对150mg·l^-1zn²⁺去除率的曲线图；

图4是在120mg/lpb²⁺初始浓度时，本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14与生物炭复合作用下对溶液中pb²⁺浓度的影响；

图5是在200mg/lpb²⁺初始浓度时，本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14与生物炭复合作用下对溶液中pb²⁺浓度的影响；

图6是在400mg/lpb²⁺初始浓度时，本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14与生物炭复合作用下对溶液中pb²⁺浓度的影响。

具体实施方式

实施例1：耐受重金属的杨树内生细菌的筛选

1.从植物体内分离和纯化内生细菌：

将新鲜的杨树样品进行植物表面消毒，干燥后置于甘露醇大豆培养基(大豆粉20g/l，甘露醇20g/l，琼脂粉20g/l，ph值7.2±0.2)上，30℃培养，待内生细菌长出，再结合划线分离法在lb固体培养基(蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉18g/l、ph5.6-5.8)上，温度30℃，培养时间1-2d，进行分离，直至获得其纯培养物。

2.杨树表面消毒实验效果的验证，具体实现方式是(以下两种方式可任选其一)：

方法一：取杨树表面消毒最后一步的洗涤水200μl均匀涂布于胰蛋白胨大豆(tsa)固体培养基(胰蛋白胨15g/l、植物蛋白胨5g/l、氯化钠5g/l、琼脂粉15g/l、ph7.3±0.2)上进行培养，培养时间一般在24h左右。在tsa培养基上无微生物生长即表示表面灭菌步骤有效。

方法二：印记对照法，将组织样品在分离培养基上放置5min后转移到新的放置点，若原放置点在培养1-2天后无微生物长出即表示表面消毒有效。

实施例2：菌株的生物学鉴定和菌株形态特征

1.菌株形态特征

(1)菌落群体形态特征：将yg-14单克隆菌落划线接种至lb固体培养基中，平板倒置于恒温培养箱，30℃培养10-18h，形成粘液状黄色菌落。在lb液体培养条件下(温度30℃，ph＝6，摇床170r/min)，yg-14在0-3h处于迟缓期，3-18h进入对数增长期，之后处于稳定期和衰亡期。

(2)菌体个体形态特征：对yg-14菌株进行革兰氏染色，利用光学显微镜观测，显示该菌株为短杆状，革兰氏阴性菌。

2.菌株16srrna分析

采用细菌基因组dna提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，抽提yg-14基因组dna，以该dna为模板，采用细菌16srrna通用引物(27f，1492r)扩增菌株16srrna片段，经过上海生工生物工程技术服务有限公司测序，见序列表，将序列与ncbi中的核酸数据库进行blast同源性比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，与数据库中已知细菌enterobacterasburiaestraindk20的16srrna序列的相似性达到了99％。将该菌株鉴定为enterobacter，肠杆菌属。使用软件mega5.0中的邻近结合法(neighbor-joiningmethod)制作yg-14的系统发育树，见附图1。

3.菌株相关生理生化实验

分别对菌株纯培养物进行淀粉水解实验、糖发酵与利用、吲哚实验、脲酶实验、柠檬酸盐、v-p实验、产铁载体试验等一系列相关生理生化实验，见附表。该菌株能利用果糖和葡萄糖，不能产生尿素酶，能分解葡萄糖产生丙酮酸，能水解淀粉将其利用，能产生β-半乳糖苷酶，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，能产生铁载体。这些生理生化特征与大部分肠杆菌属细菌生理生化特征基本一致。

表yg-14生理生化实验结果

tab.physiologicalandbiochemicalcharacteristics

注：“+”阳性，“-”阴性

实施例3：菌株重金属耐受水平检测

分别采用了稀释定量点样法和平板涂布法来检测菌株对镉、铅、锌重金属的耐受水平，并得到了该菌株的最小抑菌浓度。

1.菌落稀释法筛选耐受重金属的细菌：将od600≈1的菌株发酵液，用生理盐水将其稀释到od600≈0.1、0.01、0.001，将此四个浓度梯度的菌株发酵液，等量点样到分别添加了重金属硝酸铅、氯化锌、氯化镉的lb菌株固体培养基上，筛选得到在四个浓度上均能生长的菌落yg-14。

2.平板涂布测定最小抑菌浓度：在分别添加了不同浓度的重金属硝酸铅、氯化锌、氯化镉的lb菌株固体培养基上实施微生物平板涂布法，菌生长受到明显抑制，无法生长出肉眼可见菌株的最低金属离子浓度，为该金属的最小抑菌浓度(mic：minimuminhibitoryconcentration)。yg-14重金属铅、锌、镉的mic分别为zn²⁺(600mg/l或9.18mm)、cd²⁺(1000mg/l或8.90mm)、pb²⁺(2000mg/l或9.65mm)。该菌株耐受铅、锌、镉的能力与已知文献报道相比，处于较高水平。

实施例4：菌株在水溶液中去除重金属离子试验

1.接种肠杆菌yg-14至分别添加了氯化镉、氯化锌的液体lb培养基中，30℃，摇床170r/min，连续培养24-72h，分析计算其重金属去除率。

去除率(％)＝(c0-ceq)/c0×100％

其中：c0为重金属初始浓度(mg/l)，ceq为取样时仪器检测的实时浓度(mg/l)。

yg-14在水溶液中去除重金属锌、镉的能力很强，cd²⁺去除率达到43％(cd²⁺初始浓度100mg/l)，见附图2；zn²⁺去除率达到68％(zn²⁺初始浓度150mg/l)，见附图3。

实施例5：菌株与生物炭联合去除重金属的试验

采用杨树生物炭，反复洗涤后，105℃烘干，粉碎过筛，留取40～100目之间的颗粒，即0.1mm<粒径<0.38mm，将生物炭与本发明所提供的耐受重金属的肠杆菌yg-14结合，考察生物炭+菌复合去除剂在不同离子浓度下对重金属去除的效果，以中南林业科技大学提供的真菌ha复合生物炭作为对照。使用120、200、400mg/l的pb(no3)2溶液50ml，分别与0.2g生物炭置于250ml具塞锥形瓶中，无菌下接种菌体至锥形瓶中，30℃下振荡120r/min，分别于30min、60min、120min、180min和240min时取样，使用离心机11000r/min下离心10min，使用火焰原子吸收仪测定样品中pb²⁺浓度。

三种不同处理下(pb：杨树生物炭；pbh：杨树生物炭+ha真菌复合吸附剂；pby：杨树生物炭+yg-14细菌复合吸附剂)，杨树生物炭+yg-14细菌复合吸附剂处理对溶液中pb²⁺的吸附效果具有显著优势。其中，图4、图5和图6分别是120mg/l、200mg/l和400mg/lpb²⁺初始浓度时三种不同处理下对溶液中pb²⁺浓度的影响。

序列表

<110>湖南大学

<120>耐受重金属的杨树内生肠杆菌yg-14

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1456

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

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