本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种新n-苄基吖啶酮型生物碱及其制备方法与在制备降血脂药物中用途。
背景技术：
木耳菜(学名：gynuracusimbua)，其叶子近似木耳，它作为一种药食两用的蔬菜，在民间深受人们的喜爱。木耳菜广泛分布于我国大部分地区，资源非常丰富，营养价值极高。古书记载，木耳菜具有接筋续骨、消肿散瘀等功效，主治骨折、跌打损伤、风湿性关节炎等病症。现代药理研究发现，木耳菜具有抗氧化、抗病毒、以及抗菌消炎等多种药理活性。同时发现，木耳菜中含有多种化学成分，包括挥发油、皂苷、多糖以及各种维生素。目前，发明人查阅文献发现，未见木耳菜在降血脂方面的相关研究报道。技术实现要素：本发明目的在于选取药食两用蔬菜—木耳菜作为研究对象，利用现代提取分离技术对木耳菜化学成分进行深入研究，从中研究发现新型的天然降血脂药物，为从天然植物中研究发现新药奠定重要的物质基础。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种从木耳菜中分离的新n-苄基吖啶酮型生物碱(c31h31no10)，如式ⅰ所示：化学名：3,4-二甲氧基-10-(5'-羟基-苄基)-14,15-二甲基-1”-(2”,3”,4”-三羟基-丙基)-吡喃并吖啶-5-酮。本发明所述的n-苄基吖啶酮型生物碱的制备方法，步骤如下：步骤(1)、取干燥的木耳菜置于90～100％乙醇中，室温浸泡15～20小时，然后加热回流2～4次，每次2～4小时，静置过滤，所得滤液浓缩至无醇味，得到木耳菜总稠膏；步骤(2)、木耳菜总浸膏混悬于1.0～1.5％hcl溶液中，静置20～25小时，过滤得上清液；步骤(3)、用氨水调节上清液的ph＝10.0-12.0，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取液浓缩干燥得到氯仿稠膏、乙酸乙酯稠膏、正丁醇稠膏；步骤(4)、氯仿稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱；以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，得到3个馏分，分别为a馏分、b馏分、c馏分；步骤(5)、b馏分用石油醚溶解，湿法上硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，得到3个馏分，分别为b-1馏分、b-2馏分、b-3馏分；步骤(6)、b-2馏分用甲醇溶解，上toyopearlhw-40凝胶柱，以90～100％甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，得到b-2-1馏分和b-2-2馏分；步骤(7)、b-2-2馏分采用制备液相色谱分离纯化，得到c-2-2-1馏分；步骤(8)、c-2-2-1馏分用甲醇溶解，上sephadexlh-20凝胶柱，用95％乙腈洗脱，式ⅰ所示的n-苄基吖啶酮型生物碱。步骤(1)中，一般要求90～100％乙醇浸没药材2～4厘米即可。步骤(2)中，所述的木耳菜总稠膏和1.0～1.5％hcl溶液的体积比为1:1.5。步骤(3)中，得到的稠膏采用dii-ldl细胞吞噬实验分别进行降脂活性筛选，结果表明氯仿稠膏部位具有显著的降血脂活性。步骤(4)中，采用的硅胶为100-200目硅胶；石油醚和乙酸乙酯的体积比为15:1～5:1。采用生物活性指导分离的方法，确定b馏分为降血脂活性馏分。步骤(5)中，采用的硅胶为200-300目硅胶；正己烷和乙酸乙酯的体积比为12:1～7:1。步骤(7)中，制备液相色谱采用c18柱，流动相：90～100％甲醇，吸收波长：225nm，流速：5～7ml/min。本发明的另一个目的是提供了所述的n-苄基吖啶酮型生物碱在制备降血脂药物中的用途。本发明的有益效果：本发明n-苄基吖啶酮型生物碱结构新颖，且具有显著的降血脂活性，其制备方法简便易行，便于对其进行进一步的药理和临床研究。具体实施方式下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1n-苄基吖啶酮型生物碱的制备步骤(1)、取干燥的木耳菜(9千克)置于95％乙醇中，浸没药材2-4厘米，室温浸泡18小时；然后加热回流3小时，静置过滤，将所得滤液浓缩至无醇味，得到木耳菜总稠膏(850克)；步骤(2)、按照体积比1:1.5将木耳菜总稠膏均匀混悬于1.3％hcl溶液中，静置22小时，过滤得上清液；步骤(3)、用氨水调节上清液ph＝11，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取液浓缩干燥得到氯仿稠膏(36.8克)、乙酸乙酯稠膏(258.5克)、正丁醇稠膏(364.0克)；采用dii-ldl细胞吞噬实验分别对上述稠膏进行降脂活性筛选，筛选结果表明氯仿稠膏具有显著的降血脂活性；步骤(4)、降血脂活性部位(氯仿稠膏)用石油醚溶解，湿法上硅胶(100-200目)柱；用石油醚-乙酸乙酯(15:1→9:1→5:1)洗脱系统进行梯度洗脱，得到a馏分(8.5克)、b馏分(15.6克)、c馏分(10.2克)；采用生物活性指导分离的方法，确定b馏分为降血脂活性馏分；步骤(5)、b馏分用石油醚溶解，湿法上硅胶(200-300目)柱；用正己烷-乙酸乙酯(12:1→10:1→7:1)进行梯度洗脱，得到b-1馏分(3.6克)、b-2馏分(6.4克)、b-3馏分(4.5克)；步骤(6)、b-2馏分用甲醇溶解，上toyopearlhw-40凝胶柱，用95％甲醇和100％甲醇梯度洗脱，分别得到b-2-1(2.2克)馏分和b-2-2(3.6克)馏分；步骤(7)、b-2-2馏分采用制备液相色谱分离纯化，c18柱，流动相：90-100％甲醇，吸收波长：225nm，流速：5-7ml/min，经反复的制备、纯化，得到b-2-2-1馏分(1.8克)；步骤(8)、b-2-2-1馏分用甲醇溶解，上sephadexlh-20凝胶柱，用95％乙腈洗脱，最终得到单体化合物ⅰ(9.36毫克)。化合物ⅰ为白色粉末(丙酮)，hr-esi-msm/z600.1637[m+na]+(calcd.forc31h31no10na，600.1689)。uv(meoh)λmax:202，230，285，302nm；irνmax:3387，2913，1622，1509，1346cm-1；1h-nmr(cdcl3，400mhz)和13c-nmr(cdcl3，100mhz)数据见表1。在1h-nmr(cdcl3，400mhz)谱中，提供一个5'-羟基-苄基信号[δh5.52(2h,s,h-1′)，δh6.95(2h,d,j＝8.2hz,h-3′/7′]；一个三羟基-丙基信号[δh5.65(1h,s,h-1″)，δh3.58(4h,s,3″/4″-ch2]；两个甲氧基信号[δh3.72(3h,s,3-och3),δh3.88(3h,s,4-och3)]；一个14,15-二甲基吡喃环[δh6.86(1h,d,j＝9.9hz,h-11),δh5.64(1h,d,j＝9.9hz,h-12),δh1.42(6h,s,14,15-ch3]。结合化合物ⅰ的hmbc、noesy、1h-1hcosy等偶联相关，确定化合物结构如式ⅰ所示，化学名为：3,4-二甲氧基-10-(5'-羟基-苄基)-14,15-二甲基-1”-(2”,3”,4”-三羟基-丙基)-吡喃并吖啶-5-酮。经scifinder检索，确定化合物ⅰ为一个新n-苄基吖啶酮型生物碱。表1化合物ⅰ的1hnmr、13cnmr和hmbc相关数据实施例2化合物ⅰ的降血脂活性实验方法(1)制备dii-ldl将dii(北京中生瑞泰科技有限公司)溶解于dmso中，配制成15mg/ml的dii母液。将dii母液加入到ldl/lpds(v/v＝1:2)混合液中，使dii的终浓度为300μg/mgldl。在37℃中水浴18h。用溴化钠将混合物密度调为1.063g/ml，超速离心24h。在梯度液最上层为标记的ldl，与游离的dii分开。收集上层dii-ldl，透析24h后转移至pbs缓冲液(3l)中再透析24h。将透析好的dii-ldl用0.22μm的滤器过滤除菌，测其蛋白含量后待用。(2)用dii-ldl标记hepg2细胞将hepg2细胞(上海纪宁实业有限公司)接种在24孔板上，置于10％胎牛血清(fbs)的dmem中培养24h，根据实验目的换至含2％脱脂血清的dmem中，然后将化合物ⅰ溶解于dmso后添加至含2％脱脂血清的dmem中使其终浓度为5μm，使其饥饿24h以促进ldlr的表达，弃去旧培养液加入含dii-ldl(20μg/ml)的无血清培养液300μl/孔，在37℃培养2-3h，测定总细胞相关ldl摄取量。(3)测定荧光值用含0.4％牛血清白蛋白(bsa)的pbs缓冲液小心冲洗2遍，去除24孔板中的培养基，pbs冲洗3遍，洗去多余染料的细胞，加异丙醇(0.5ml/每24孔板单孔)。摇床20min后，收集异丙醇，超速离心15min(3000rpm)，吸取上清液200μl置于黑色荧光板中，在激发光520nm和发射光570nm处测定荧光强度。实验结果采用dii-ldl细胞吞噬实验来测定化合物ⅰ的降血脂活性，化合物的浓度为5μm，以与空白对照(dmso)的比值来显示吞噬率，当吞噬率大于1.36时，被认为具有显著的降血脂活性，其结果见表2所示。表2化合物ⅰ的脂质吞噬率结果化合物吞噬率氯仿稠膏1.96±0.09b馏分1.75±0.11化合物ⅰ1.51±0.04由表2可知，n-苄基吖啶酮型生物碱具有显著的降血脂活性。当前第1页12