本发明属于化学药物技术领域，具体涉及一种吡唑并嘧啶类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
c-met是肝细胞生长因子(hgf)的受体，也是异二聚体的受体酪氨酸激酶(rtks)亚家族的成员之一。当hgf与受体c-met结合后，细胞信号广泛传导，包括参与细胞的增殖、运动、迁移和侵袭。重要的是，异常传导的hgf/c-met信号是多种恶性肿瘤的驱动因子，其能促进肿瘤生长、侵袭、传播和血管的生成。一些药物临床治疗效果不佳和已获批准的靶向治疗药物的耐药性均与
hgf/c-met信号异常有关。因此，c-met激酶有望成为肿瘤药物开发的一个靶点。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种吡唑并嘧啶类化合物，能有效抑制多种肿瘤细胞，具有很好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种吡唑并嘧啶类化合物，所述吡唑并嘧啶类化合物的结构通式如式(ⅰ)所示：
式中，r基选自苯基、苄基、嘧啶基、吡啶基、吡嗪基、卤素取代的苯基、卤素取代的苄基、甲氧基取代的苯基、甲氧基取代的苄基、甲氧基和卤素取代的苯基、甲氧基和卤素取代的苄基、甲氧基和卤素取代的嘧啶基、甲氧基和卤素取代的吡啶基、甲氧基和卤素取代的吡嗪基、甲基取代的吡嗪基。
优选地，所述卤素取代的苯基中卤素选自f、cl、br；所述卤素取代的苄基中卤素选自f、cl、br。
优选地，所述吡唑并嘧啶类化合物为7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶、7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶、7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶、7-[2-氟-4-(2-吡啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶、7-[2-氟-4-(4-氟苯甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶、7-[2-氟-4-(3-氟-4-甲氧基苯甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶。
本发明还提供了所述吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶：取3-氨基吡唑和乙酰乙酸乙酯，加入冰醋酸，加热搅拌均匀，于100～140℃中反应1.5～2.5h，冷却，抽滤，用无水乙醇洗涤上层沉淀，得到白色固体，即为所述5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶；
(2)合成中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶：依次取5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶、n,n-二甲苯胺或二乙胺或三乙胺和三氯氧磷，搅拌均匀，于30～40℃反应36～48h，在冰浴条件下，将反应体系边搅拌边缓慢倒入冰水中，恢复常温后，加入氢氧化钠溶液调节ph至中性，过滤，滤液用二氯甲烷或三氯甲烷进行萃取，收集萃取液，干燥，过滤，滤液旋蒸，过层析柱，得到透明油状液体，即为所述5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶；
(3)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶：取5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶，用氯苯溶解，然后加入2-氟-4-硝基苯酚，加热搅拌均匀，在90～120℃反应2～3h，减压浓缩，过层析柱，得到黄绿色固体，即为所述5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶；
(4)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶：称取还原铁粉和醋酸溶液或甲酸溶液或氯化铵溶液，加热搅拌，70～90℃活化0.5～1.5h，加入5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，反应3-5h，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，取上层液体，干燥，旋蒸，过层析柱，得白色固体，即为所述5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶；
(5)合成所述吡唑并嘧啶类化合物：在0～5℃条件下，取r基相对应的原料和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，用二氯甲烷溶解，搅拌均匀后，加入n,n-二异丙基乙胺，继续搅拌均匀，然后滴加5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的二氯甲烷溶液，搅拌均匀后，于30～40℃条件下反应12～24h，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，过滤，粗品过层析柱，得到棕黄色固体，即为所述吡唑并嘧啶类化合物。
优选地，所述步骤(1)中3-氨基吡唑和乙酰乙酸乙酯的摩尔比为(1～1.2)：1。
优选地，所述步骤(1)中3-氨基吡唑和乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1：1。
优选地，所述步骤(1)中于120℃中反应1.5h。
优选地，所述步骤(2)中5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶、n,n-二甲苯胺或二乙胺或三乙胺和三氯氧磷的摩尔比为1：(3～5)：(6～10)。
优选地，所述步骤(2)中5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶、n,n-二甲苯胺或二乙胺或三乙胺和三氯氧磷的摩尔比为1：4：8。
优选地，所述步骤(2)中滤液用二氯甲烷或三氯甲烷萃取三次。
优选地，所述步骤(2)中萃取液用无水硫酸钠进行干燥。
优选地，所述步骤(2)中于35℃反应36h。
优选地，所述步骤(3)中5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶与2-氟-4-硝基苯酚的质量比为(1.186～1.423)：(1.115～1.395)。
优选地，所述步骤(3)中5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶与2-氟-4-硝基苯酚的质量比为1.21：1.354。
优选地，所述步骤(3)中在110℃反应2h。
优选地，所述步骤(4)中还原铁粉与5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的摩尔比为(2～4):1。
优选地，所述步骤(4)中还原铁粉与5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的摩尔比为3:1。
优选地，所述步骤(4)中滤液用乙酸乙酯萃取三次；所述上层液体用无水硫酸钠进行干燥。
优选地，所述步骤(4)中称取还原铁粉和醋酸溶液或甲酸溶液或氯化铵溶液，加热搅拌，90℃活化1h，加入5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，反应5h。
优选地，所述步骤(5)中r基相对应的原料、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺和5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的摩尔比为(0.5～1.0)：(0.5～1.0)：(0.9～1.7)：(0.4～0.8)。
优选地，所述步骤(5)中r基相对应的原料、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺和5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的摩尔比为0.576：0.576：1.056：0.480。
优选地，所述步骤(5)中有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，然后用无水硫酸钠干燥。
优选地，所述步骤(5)中于30℃条件下反应12h。
本发明所述吡唑并嘧啶类化合物的合成路线如下：
本发明还提供了所述的吡唑并嘧啶类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明提供的吡唑并嘧啶类化合物具有很好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
优选地，所述肿瘤是由hgf/c-met信号通路转导异常引起的。
优选地，所述肿瘤包括人乳腺癌、人肺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤细胞。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包含所述的吡唑并嘧啶类化合物和药物学可接受的载体。
优选地，所述肿瘤是由hgf/c-met信号通路转导异常引起的。
优选地，所述肿瘤包括人乳腺癌、人肺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤细胞。
优选地，所述抗肿瘤药物的剂型包括注射剂型和口服剂型。
优选地，所述注射剂型包括注射液和冻干粉。
优选地，所述口服剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂和溶液剂。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明以3-氨基吡唑和乙酰乙酸乙酯衍生物为原料，合成中间体吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，再经过氯代、成醚、还原和成酰胺反应首次合成一系列具有抗肿瘤活性的吡唑并嘧啶类化合物，并通过高分辨质谱、核磁共振氢谱和碳谱对其进行结构了确证；(2)体外肿瘤细胞抑制活性的测试显示所述吡唑并嘧啶类化合物对人神经母细胞瘤细胞、人乳腺癌细胞、人肺腺癌细胞和人肝癌细胞等肿瘤细胞均具有良好的抑制作用(ic50<100μm)，具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物；(3)本发明所述吡唑并嘧啶类化合物具有抑制或杀灭肿瘤细胞，可以制备治疗人乳腺癌、人肺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤的抗肿瘤药物；(4)本发明吡唑并嘧啶类化合物制备方法具有操作工艺简单、合成路线短和成本低等优点。
附图说明
图1为5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶的1hnmr和13cnmr图谱。
图2为5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶的1hnmr和13cnmr图谱。
图3为5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的1hnmr和13cnmr图谱。
图4为5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶的1hnmr和13cnmr图谱。
图5为7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(gmzc-hcn-01)的1hnmr和13cnmr图谱。
图6为7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(gmzc-hcn-02)的1hnmr和13cnmr图谱。
图7为7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(gmzc-hcn-03)的1hnmr和13cnmr图谱。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明吡唑并嘧啶类化合物制备方法的一种实施例，所述化合物名称为7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶，r基为3,5,6-三甲基吡嗪，制备方法包括以下步骤：
(1)合成中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取3-氨基吡唑4.860g(58.000mmol)和乙酰乙酸乙酯7.541g(58.000mmol)加入圆底烧瓶中，加入20ml的冰醋酸作为反应溶剂，加热搅拌，在120℃中反应1.5h，tlc检测；反应结束后，冷却，抽滤，用无水乙醇洗涤上层沉淀，得到白色固体6.103g，即为所述中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图1所示)，产率70％；
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.28(s,1h),7.82(t,j＝2.4hz,1h),6.11～6.03(m,1h),5.59～5.52(m,1h),2.28(d,j＝0.6hz,3h)；
13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ156.83,150.70,143.14,142.12,95.36,88.74,19.10；
(2)合成中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶2.500g(16.800mmol)加入圆底烧瓶中，依次加入n,n-二甲苯胺8.450ml(67.100mmol)和三氯氧磷12.25ml(134.400mmol)，搅拌，在35℃反应36h，tlc检测；反应结束后，在冰浴情况下，将反应体系一边搅拌一边缓慢倒入装有100ml冰水的烧杯中，淬灭三氯氧磷，待恢复常温，加入氢氧化钠溶液调节ph至中性，过滤，用dcm萃取滤液三次，每次100ml，无水硫酸钠干燥萃取液，过滤，滤液旋蒸得紫黑色水状液体，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶12]，得到透明油状液体2.013g，即为所述中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图2所示)，产率70％；
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.97(t,j＝3.3hz,1h),6.64(s,1h),6.46(d,j＝2.3hz,1h),2.39(d,j＝3.4hz,3h)；
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ158.37,149.39,145.22,138.11,108.75,97.24,24.52；
(3)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶1.210g(7.100mmol)加入圆底烧瓶，加入2ml氯苯溶解，倒入2-氟-4-硝基苯酚1.354g(8.500mmol)，加热搅拌，在110℃反应2h，反应结束后，减压浓缩，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶10]，得到黄绿色固体1.030g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图3所示)，产率50％；
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.22～8.15(m,2h),8.13(d,j＝2.2hz,1h),7.52～7.46(m,1h),6.64～6.60(m,1h),5.90(s,1h),2.52(d,j＝0.5hz,3h)；
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ160.56,154.56,151.99,150.76,145.97,144.72,123.37,121.07,114.26,114.03,96.56,90.71,25.20；
(4)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取还原铁粉0.588g(10.500mmol)加入装有20mlph＝2-3醋酸溶液的圆底烧瓶中，加热搅拌，90℃活化1h，加入5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶1.008g(3.500mmol)，反应5h；反应结束后，趁热过滤，用乙酸乙酯萃取滤液三次，每次50ml，取上层，用无水硫酸钠干燥，旋蒸，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶8]，得白色固体0.650g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图4所示)，产率72％；
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.96(s,1h),9.60(s,1h),8.08(d,j＝2.2hz,1h),7.25(dd,j＝12.3,2.4hz,1h),7.06(ddd,j＝28.4,10.3,4.6hz,2h),6.35(d,j＝2.2hz,1h),6.03(s,1h),2.34(s,3h)；
13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ159.47,152.43,150.03,149.43,145.87,143.93,129.11,121.96,118.49,113.96,94.36,86.61,25.04；
(5)合成产物7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶
在0℃条件下，称取3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸0.095g(0.576mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)0.219g(0.576mmol)放入圆底烧瓶中，用8mldcm溶解，搅拌10min后，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)0.183ml(1.056mmol)，继续搅拌10min，缓慢滴加5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶0.124g(0.480mmol)的dcm溶液，10min后将体系置于30℃条件下反应12h，tlc检测；反应完毕后用饱和氯化钠溶液洗有机相三次，洗去反应副产物，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，得到粗品，过层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶6]，得到白色固体0.060g，即为所述产物7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图5所示)，产率约31％。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.99(s,1h),8.10(d,j＝2.2hz,1h),7.58～7.52(m,1h),7.51～7.46(m,1h),7.42～7.36(m,1h),6.38(d,j＝2.3hz,1h),6.34(d,j＝4.1hz,1h),2.69(d,j＝2.2hz,3h),2.53(s,3h),2.51(s,3h),2.37(s,3h)；
13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ167.61,163.66,156.48,154.46,152.71,152.14,150.35,144.57,144.05,137.30,134.95,125.18,120.52,112.68,112.47,94.75,87.57,25.10,22.77,22.50,21.62。
将本实施例制备得到的7-[2-氟-4-(3,5,6-三甲基吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶编号为gmzc-hcn-01。
实施例2
本发明吡唑并嘧啶类化合物制备方法的一种实施例，所述化合物名称为7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶，r基为2-吡嗪基，制备方法包括以下步骤：
(1)合成中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取3-氨基吡唑69.600mmol和乙酰乙酸乙酯58.000mmol加入圆底烧瓶中，加入20ml的冰醋酸作为反应溶剂，加热搅拌，在100℃中反应2.5h，tlc检测；反应结束后，冷却，抽滤，用无水乙醇洗涤上层沉淀，得到白色固体6.103g，即为所述中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率70％；
(2)合成中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶2.500g(16.800mmol)加入圆底烧瓶中，依次加入二乙胺50.400mmol和三氯氧磷100.800mmol，搅拌，在30℃反应48h，tlc检测；反应结束后，在冰浴情况下，将反应体系一边搅拌一边缓慢倒入装有100ml冰水的烧杯中，淬灭三氯氧磷，待恢复常温，加入氢氧化钠溶液调节ph至中性，过滤，用三氯甲烷萃取滤液三次，每次100ml，无水硫酸钠干燥萃取液，过滤，滤液旋蒸得紫黑色水状液体，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶12]，得到透明油状液体2.013g，即为所述中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率70％；
(3)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶1.186g加入圆底烧瓶，加入2ml氯苯溶解，倒入2-氟-4-硝基苯酚1.115g，加热搅拌，在90℃反应3h，反应结束后，减压浓缩，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶10]，得到黄绿色固体1.030g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率50％；
(4)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取还原铁粉7.000mmol加入装有20mlph＝2-3甲酸溶液的圆底烧瓶中，加热搅拌，70℃活化1.5h，加入5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶3.500mmol，反应4h；反应结束后，趁热过滤，用乙酸乙酯萃取滤液三次，每次50ml，取上层，用无水硫酸钠干燥，旋蒸，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶8]，得白色固体0.650g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率72％；
(5)合成产物7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶
在5℃条件下，称取吡嗪-2-甲酸0.500mmol和2-(7-氧化苯并三氮唑)
-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)0.500mmol放入圆底烧瓶中，用8mldcm溶解，搅拌10min后，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)0.900mmol，继续搅拌10min，缓慢滴加5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶0.400mmol的dcm溶液，10min后将体系置于40℃条件下反应15h，tlc检测；反应完毕后用饱和氯化钠溶液洗有机相三次，洗去反应副产物，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，得到粗品，过层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶6]，得到白色固体0.060g，即为所述产物7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图6所示)，产率约37％。
将本实施例制备得到的7-[2-氟-4-(吡嗪甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶编号为gmzc-hcn-02。
实施例3
本发明吡唑并嘧啶类化合物制备方法的一种实施例，所述化合物名称为7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶，r基为5-嘧啶基，制备方法包括以下步骤：
(1)合成中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取3-氨基吡唑63.800mmol和乙酰乙酸乙酯58.000mmol加入圆底烧瓶中，加入20ml的冰醋酸作为反应溶剂，加热搅拌，在140℃中反应1.8h，tlc检测；反应结束后，冷却，抽滤，用无水乙醇洗涤上层沉淀，得到白色固体6.103g，即为所述中间体5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率70％；
(2)合成中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-羟基-吡唑并[1,5-a]嘧啶2.500g(16.800mmol)加入圆底烧瓶中，依次加入三乙胺84.000mmol和三氯氧磷168.000mmol，搅拌，在40℃反应40h，tlc检测；反应结束后，在冰浴情况下，将反应体系一边搅拌一边缓慢倒入装有100ml冰水的烧杯中，淬灭三氯氧磷，待恢复常温，加入氢氧化钠溶液调节ph至中性，过滤，用dcm萃取滤液三次，每次100ml，无水硫酸钠干燥萃取液，过滤，滤液旋蒸得紫黑色水状液体，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶12]，得到透明油状液体2.013g，即为所述中间体5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率70％；
(3)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取5-甲基-7-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶1.423g加入圆底烧瓶，加入2ml氯苯溶解，倒入2-氟-4-硝基苯酚1.395g，加热搅拌，在120℃反应2.5h，反应结束后，减压浓缩，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶10]，得到黄绿色固体1.030g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率50％；
(4)合成中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶
称取还原铁粉14.000mmol加入装有20mlph＝4～5氯化铵溶液的圆底烧瓶中，加热搅拌，88℃活化0.5h，加入5-甲基-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶3.500mmol，反应3h；反应结束后，趁热过滤，用乙酸乙酯萃取滤液三次，每次50ml，取上层，用无水硫酸钠干燥，旋蒸，层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶8]，得白色固体0.650g，即为所述中间体5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶，产率72％；
(5)合成产物7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶
在2℃条件下，称取5-嘧啶甲酸1.000mmol和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)1.000mmol放入圆底烧瓶中，用8mldcm溶解，搅拌10min后，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)1.700mmol，继续搅拌10min，缓慢滴加5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶0.800mmol的dcm溶液，10min后将体系置于35℃条件下反应24h，tlc检测；反应完毕后用饱和氯化钠溶液洗有机相三次，洗去反应副产物，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，得到粗品，过层析柱[v：v(乙酸乙酯∶石油醚)＝1∶6]，得到白色固体0.060g，即为所述产物7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(1hnmr和13cnmr图谱如图7所示)，产率约42％。
将本实施例制备得到的7-[2-氟-4-(5-嘧啶甲酰胺基)苯氧基]-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶编号为gmzc-hcn-03。
实施例4
本发明所述吡唑并嘧啶类化合物的结构通式如式(ⅰ)所示：
式中，r基选自苯基、苄基、嘧啶基、吡啶基、吡嗪基、卤素取代的苯基、卤素取代的苄基、甲氧基取代的苯基、甲氧基取代的苄基、甲氧基和卤素取代的苯基、甲氧基和卤素取代的苄基、甲氧基和卤素取代的嘧啶基、甲氧基和卤素取代的吡啶基、甲氧基和卤素取代的吡嗪基、甲基取代的吡嗪基。
所述吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，除了步骤(5)中取相应r基的原料进行反应，其他反应步骤均相同。本实施例提供如表1所示的化合物的制备方法，相应化合物除步骤(5)中与2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺和5-甲基-7-(2-氟-4-氨基苯氧基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶进行反应的r基的原料不同外，其他反应条件同实施例1。
表1化合物及反应原料
实施例5
本实施例研究本发明编号为gmzc-hcn-01～gmzc-hcn-24的吡唑并嘧啶类化合物的抗肿瘤活性。
1.药物试剂预处理
待测化合物的配制：用dmso将相应编号的化合物溶解成浓度100mm储备液，测定时用无血清培养基稀释至0～500μm，现配现用。
2.实验方法
(1)利用sh-sy5y细胞测试抗肿瘤活性：
采用rpmimedium1640培养基，10％南美胎牛血清(fbs)，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素,于37℃5％co2培养箱中培养。待细胞状态良好时将细胞接种到96孔板当中，密度为7300个/孔，于37℃5％co2培养箱中继续培养，待其完全贴壁后，加入100μl含不同化合物浓度的不含血清的培养基。孵育72h，吸走培养液，加入110μl含有10μlcck8和100μl培养基的混合液，继续孵育1-4h。选取cabozantinib和5-fluorouracil作为阳性对照药物，同时设立空白组和调零组。酶标仪于450nm和630nm处测其吸光值。将所得数据进行处理，计算每个化合物的抑制率。将抑制率对不同化合物的对应浓度作图，所得数据用spss19.0统计软件处理的，计算ic50值。抑制率的计算公式：[1-(实验组-背景组)/(空白组-调零组)]*100％。各实验组设6复孔，实验结果以3次独立实验的mean±sd表示。
(2)利用mda-mb-231细胞测试抗肿瘤活性：
采用高糖dmem培养基，10％南美胎牛血清(fbs)，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素,于37℃5％co2培养箱中培养。待细胞状态良好时将细胞接种到96孔板当中，密度为4000个/孔，于37℃5％co2培养箱中继续培养，待其完全贴壁后，加入100μl含不同化合物浓度的不含血清的培养基。孵育72h，吸走培养液，加入110μl含有10μlcck8和100μl培养基的混合液，继续孵育1-4h。选取cabozantinib和5-fluorouracil作为阳性对照药物，同时设立空白组和调零组。用酶标仪于450nm和630nm处测其吸光值。将所得数据进行处理，计算每个化合物的抑制率。将抑制率对不同化合物的对应浓度作图，所得数据用spss19.0统计软件处理的，计算ic50值。抑制率的计算公式：[1-(实验组-背景组)/(空白组-调零组)]*100％。各实验组设6复孔，实验结果以3次独立实验的mean±sd表示。
(3)利用a549细胞测试抗肿瘤活性：
采用rpmimedium1640培养基，10％南美胎牛血清(fbs)，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素,于37℃5％co2培养箱中培养。待细胞状态良好时将细胞接种到96孔板当中，密度为6500个/孔，于37℃5％co2培养箱中继续培养，待其完全贴壁后，加入100μl含不同化合物浓度的不含血清的培养基。孵育72h，吸走培养液，加入110μl含有10μlcck8和100μl培养基的混合液，继续孵育1-4h。选取cabozantinib和5-fluorouracil作为阳性对照药物，同时设立空白组和调零组。用酶标仪于450nm和630nm处测其吸光值。将所得数据进行处理，计算每个化合物的抑制率。将抑制率对不同化合物的对应浓度作图，所得数据用spss19.0统计软件处理的，计算ic50值。抑制率的计算公式：[1-(实验组-背景组)/(空白组-调零组)]*100％。各实验组设6复孔，实验结果以3次独立实验的mean±sd表示。
(4)利用hepg2细胞测试抗肿瘤活性：
细胞使用高糖dmem培养基，10％南美胎牛血清(fbs)，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素,于37℃5％co2培养箱中培养。待细胞状态良好时将细胞接种到96孔板当中，密度为6500个/孔，于37℃5％co2培养箱中继续培养，待其完全贴壁后，加入100μl含不同化合物浓度的不含血清的培养基。孵育72h，吸走培养液，加入110μl含有10μlcck8和100μl培养基的混合液，继续孵育1-4h。选取cabozantinib和5-fluorouracil作为阳性对照药物，同时设立空白组和调零组。用酶标仪于450nm和630nm处测其吸光值。将所得数据进行处理，计算每个化合物的抑制率。将抑制率对不同化合物的对应浓度作图，所得数据用spss19.0统计软件处理的，计算ic50值。抑制率的计算公式：[1-(实验组-背景组)/(空白组-调零组)]*100％。各实验组设6复孔，实验结果以3次独立实验的mean±sd表示。
3.实验结果
实验结果如表2所示：
表2本发明吡唑并嘧啶类化合物抗肿瘤活性实验结果
由上述实验结果可以看出，本发明提供的吡唑并嘧啶类化合物可以抑制或杀灭肿瘤细胞，部分化合物与上市药物cabozantinib具有相当的抗肿瘤活性，可以用于制备治疗人神经母细胞瘤、人乳腺癌、人肺癌和人肝癌等肿瘤的药物，能有效治疗肿瘤。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。