本发明涉及环境生物
技术领域：
，尤其涉及一种用于溢油修复的新型固定化酶的制备方法。
背景技术：
石油污染是指在开采、炼制、贮运、使用的过程中，原油和各种石油制品进入环境而造成的污染。当前主要是石油对海洋的污染，已成为世界性的严重问题。石油污染不是单一的问题，由其会引起土壤、水体、空气等连锁污染问题。海洋石油污染危害是多方面的.如在水面形成油膜.阻碍了水体与大气之间的气体交换：油类粘附在鱼类、藻类和浮游生物上，致使海洋生物死亡，并破坏海鸟生活环境，导致海鸟死亡和种群数量下降。石油污染还会使水产品品质下降.造成经济损失。20世纪80年代以前.治理石油烃污染土壤还仅限于物理和化学方法，即热处理和化学浸出法，但是会破坏土壤结构和组分，价格昂贵而很难实施。目前，石油污染的生物修复途径主要以微生物修复为主。生物修复是利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度，使污染土壤恢复到健康状态的过程。生物治理是世界公认，具有安全无毒、高效修复石油污染的特点，采用该技术处理降解清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的意义和应用价值。而在微生物修复技术中，酶降解技术占了很大的比重。作为一种生物降解剂，酶具有比一般化学催化剂效率高，绿色环保等特点。但是在海洋溢油生物修复过程中，存在着酶流失严重，酶活性大幅度下降，修复效率变低等问题。此外，海洋溢油多位于海体表面，需要酶制剂漂浮于水面上。因此，寻找一种用于溢油修复的新型酶是本领技术人员亟待解决的技术问题。技术实现要素：本发明为了克服溢油修复中传统酶降解技术存在着酶流失严重、酶活性降低、修复率低的问题，提供了一种机械强度较高、传质性能较高、修复率高、适合规模化生产与应用的用于溢油修复的新型固定化酶的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于溢油修复的新型固定化酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养7～15天，得到藻液；(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤得到富集着藻体的滤膜，将富集着藻体的滤膜于液氮中冷却30～60s后取出，加入3～5g石英砂于研钵中进行研磨，用磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到酶解液；(3)将步骤(2)所得的酶解液加入魔芋葡甘聚糖气凝胶溶液，搅拌均匀,于-10～-30℃温度条件下，预冷冻8～16h，得冷冻接种液；魔芋葡甘聚糖是由葡萄糖和β-1,4糖苷键连起来的高分子多糖，具有高粘度、良好的成膜性和凝胶性，具有一定的生物活性；(4)将步骤(3)得到冷冻接种液冷冻干燥处理，得到含有酶的魔芋葡甘聚糖气凝胶；(5)将步骤(4)中所得的含有酶的魔芋葡甘聚糖气凝胶粉碎成小颗粒，即得用于溢油修复的新型固定化酶。本发明制备的用于溢油修复的新型固定化酶在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。固定化酶技术与其它生物修复技术相比，能够保持酶活性的稳定，增加酶密度，提高降解率，处理效率高，对环境的耐受力强，并且可反复利用，回收率高，能够有效提高目标区域内海洋溢油污染。作为优选，步骤(1)中，富集培养的工艺条件为：将培养基用海水煮沸10～20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为nh4cl0.1～0.3g/l，k2hpo40.05～0.1g/l和柠檬酸铁0.005～0.02g/l。为开展后期的小球藻粗酶液提取实验及藻种传代，进行小球藻的富集培养。所述富集培养为：将培养基用海水煮沸12～18min，抽滤后为补充小球藻生长必要的营养物质，添加相应的营养盐，添加nh4cl为补充氮源、k2hpo4在补充磷源的同时可以补充营养元素钾、柠檬酸铁的添加则可满足小球藻在生长过程中对铁元素的需要，因此这三种营养盐中各组分的浓度分别为nh4cl0.2g/l，k2hpo40.05g/l和柠檬酸铁0.01g/l。作为优选，步骤(2)中，研磨温度为0～4℃。作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为1.0～1.5mmol/l。作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的ph为7.0～8.2。作为优选，步骤(3)中，所述魔芋葡甘聚糖气凝胶为经过纳米光催化剂交联改性的魔芋葡甘聚糖气凝胶。经过纳米光催化剂交联改性的魔芋葡甘聚糖气凝胶，在保持魔芋葡甘聚糖气凝胶网络结构的基础上，负载纳米光催化剂，使得本发明用于溢油修复的新型固定化酶的降解的过程中，充分利用自然界的光，与光催化氧化还原降解有机物的作用协同增效，提高溶油降解率。作为优选，所述纳米光催化剂为碳纳米管/g-c3n4复合催化剂，具有较好的生物相容性，和较大的比表面积，同时属于可见光催化剂，大大拓展了光利用率，光催化降解溶油有机物的效率高。因此，本发明具有如下有益效果：(1)固定化酶溢油降解剂的机械强度较高，耐物理冲击，传质性能较高，同时固定化酶溢油降解剂的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地降解石油，无毒副残留；气凝胶材料吸附力好，多孔，孔隙率高，孔径大；制作成本较低，制备过程简单易行，适合规模化生产与应用；(2)小球藻作为广泛存在的微生物，具有易培养、繁殖较快等特点。本发明中小球藻为从溢油事故现场采集、分离、培养而得，经过驯化后，具有高效降解率，在此基础上，配合气凝胶材料吸附效果，降解效果明显；(3)采用光催化剂改性的气凝胶材料，利用光催化作用进一步提高降解清除溢油的效果。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。实施例1(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养15天，得到藻液；富集培养的工艺条件为：将培养基用海水煮沸10min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为nh4cl0.1g/l，k2hpo40.1g/l和柠檬酸铁0.02g/l；(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却30s后取出，加入3g石英砂于研钵中进行研磨，研磨温度为0℃；用ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到酶解液；(3)将步骤(2)所得的酶解液加入魔芋葡甘聚糖气凝胶溶液，搅拌均匀,放入-10℃冰箱，预冷冻8h；(4)将步骤(3)得到冷冻接种液放入冷冻干燥机，冷冻干燥处理，得到含有酶的魔芋葡甘聚糖气凝胶；(5)将步骤(4)中得到含酶气凝胶粉碎成小颗粒，得到用于溢油修复的新型固定化酶。实施例2(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养20天，得到藻液；富集培养的工艺条件为：将培养基用海水煮沸20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为nh4cl0.3g/l，k2hpo40.05g/l和柠檬酸铁0.005g/l；(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却60s后取出，加入4g石英砂于研钵中进行研磨，研磨温度为4℃；用ph为8.2的磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到酶解液；(3)将步骤(2)所得的酶解液加入魔芋葡甘聚糖气凝胶溶液，搅拌均匀,放入-20℃冰箱，预冷冻12h；(4)将步骤(3)得到冷冻接种液放入冷冻干燥机，冷冻干燥处理，得到含有酶的魔芋葡甘聚糖气凝胶；(5)将步骤(4)中得到含酶气凝胶粉碎成小颗粒，得到用于溢油修复的新型固定化酶。实施例3(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养20天，得到藻液；富集培养的工艺条件为：将培养基用海水煮沸10～20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为nh4cl00.2g/l，k2hpo40.08g/l和柠檬酸铁0.01g/l；(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却90s后取出，加入4g石英砂于研钵中进行研磨，研磨温度为3℃；用磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到酶解液；(3)将步骤(2)所得的酶解液加入魔芋葡甘聚糖气凝胶溶液，搅拌均匀,放入-25℃冰箱，预冷冻18h；(4)将步骤(3)得到冷冻接种液放入冷冻干燥机，冷冻干燥处理，得到含有酶的魔芋葡甘聚糖气凝胶；(5)将步骤(4)中得到含酶气凝胶粉碎成小颗粒，得到用于溢油修复的新型固定化酶。实施例4实施例4与实施例1的区别在于，步骤(3)中，所用芋葡甘聚糖气凝胶为经过碳纳米管/g-c3n4复合催化剂交联改性的魔芋葡甘聚糖气凝胶。其中，碳纳米管/g-c3n4复合催化剂由市售工业级碳纳米管和g-c3n4水溶液按照物质的量1:1共混后，于150℃水热反应6h制得。将实施例1-4制得用于溢油修复的新型固定化酶分别进行作用到模拟溢油环境，检测溢油降解效果。采用分光光度法对实施例1-4中培养基中剩余油量测定。过滤除去气凝胶，用30ml脱芳石油醚作为溶剂，清洗培养瓶中剩余培养基，并转移至分液漏斗，加入无水硫酸钠吸水，除水层，吸取0.5ml上层油，用石油醚定容至10ml。在420nm条件下测定吸光值，参照原油标准曲线判定降解性能，结果如表1所示。表1.测定结果性能指标实施例1实施例2实施例3实施例4吸油率14.46g/g15.24g/g17.95g/g20.15g/g降解率75.40％82.12％85.78％90.25％由表1可以看出，采用本发明工艺制备的用于溢油修复的新型固定化酶可有效固定酶，并保持其生长活性，原油吸附效果和微藻降解效果较好。其中，经过光催化剂改性的用于溢油修复的新型固定化酶的微藻降解效果更佳。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。当前第1页12