玉米胚乳发育基因mn1紧密连锁的分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一种玉米胚乳发育基因mnl紧密连锁的indel分子标记，扩增其的引物对以及该分子标记的应用。

背景技术：

玉米是重要的粮食和饲料作物，籽粒发育是粮食作物的重要性状。玉米籽粒的主要构成部分是胚乳，胚乳约占整个籽粒重量的73％-85％，其主要成分为淀粉(直链淀粉和支链淀粉)和蛋白质，所以籽粒中胚乳能否正常发育对玉米的产量和品质都具有重要意义。由于玉米种质资源匮乏和自交系遗传基础狭窄，通过自然筛选或人工诱变的方式获得的突变体已经被作为一种遗传学研究的基本材料，用来研究基因的生物学功能。目前，越来越多的胚乳表型突变体已经被鉴定，其中一部分胚乳突变体基因已经找到与之连锁的分子标记，并应用到商业化育种中，如sh1(皱缩型)，su1(甜质型)，wx1(腊质型)等。

分子标记可以直接反应dna的遗传多态性，其原理是依据个体间遗传物质中核苷酸序列的变异。其中indel(insertion/deletion)分子标记是指根据不同个体间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失而设计的多态性引物，基因型判断简单且快速。因此，开发和利用新的胚乳发育相关基因紧密连锁的indel分子标记，对玉米育种具有重要指导意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明首先从玉米胚乳发育突变体emp13中克隆到发生突变的编码基因为mn1(miniature1)，该基因与玉米籽粒胚乳发育密切相关(chengetal.,plantcell,1996；lietal.,plantbiotechnologyjournal,2013)。本发明发现相比野生型mn1基因，突变体mn1基因在第一个外显子(atg下游18bp处)发生166bp序列插入，并验证了该基因可以调控玉米籽粒灌浆过程，然后设计了与基因mn1连锁的indel分子标记以及扩增该分子标记的引物。该indel分子标记引物可用来鉴定玉米胚乳发育基因mn1，检测玉米灌浆性状是否正常。

本发明的第一个目的在于提供了玉米胚乳发育基因mn1紧密连锁的的indel分子标记。

本发明的第二个目的是提供用于扩增上述indel分子标记的pcr引物。

本发明的第三个目的是提供上述indel分子标记引物在鉴别玉米胚乳发育野生型基因mn1和突变体基因mn1中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：申请人利用图位克隆方式定位到玉米胚乳发育突变体基因emp13即为mn1，该突变体为田间筛选到的自然突变体，表现为灌浆缺陷。测序发现，相比野生型基因mnl，突变体基因mn1第一个外显子发生166bp序列插入，以此设计了鉴别玉米籽粒灌浆正常与否的indel分子标记及扩增该分子标记的引物。提取野生型mn1和突变体mn1的基因组dna，利用上述分子标记引物进行pcr反应，最终确定该分子标记在两个亲本间多态性良好，分辨率较高。

本发明提供的玉米胚乳发育基因mn1紧密连锁的indel分子标记，其特征是，

与玉米胚乳发育野生型基因mn1检测相关的核苷酸序列如下(seqidno.1)：tgtgatatggcagctaagagctagttttcaacaagtttgtttctataatagtatagctagatagacagacacgtagctaaaatggtcaactgaccttcgtacaaaaaaaaactttaatccagagatatagcaatatatgcttataactccagacctcagagtcaacccacagatttttgtatattcgtcaaaaagatccacagatttgtggtagagagtatgttttagtagtagtggtatatctcccttgtgggacgacgaagcagccggtcagccggcgctccggccggccggccggcctgcgcctgcacagtacaaatagcaccccccgtcctccagttggctgcatccttctagcttcgatctctatatacctctgtatgtgagtgaggccaatgagagccctcgtagtcgtaagtttcgcttcggcgtgcttgctgctgctgttgcagctcgcaggagcgtcgcatgtcgtctacaactacaaggacctcg。

与玉米胚乳发育突变体基因mn1检测相关的核苷酸序列如下(下划线部分为插入序列，seqidno.2)：

tgtgatatggcagctaagagctagttttcaacaagtttgtttctataatagtatagctagatagacagacacgtagctaaaatggtcaactgaccttcgtacaaaaaaaaactttaatccagagatatagcaatatatgcttataactccagacctcagagtcaacccacagatttttgtatattcgtcaaaaagatccacagatttgtggtagagagtatgttttagtagtagtggtatatctcccttgtgggacgacgaagcagccggtcagccggcgctccggccggccggccggcctgcgcctgcacagtacaaatagcaccccccgtcctccagttggctgcatccttctagcttcgatctctatatacctctgtatgtgagtgaggccaatgagagccctcgtagttagggctgacaatgggcctcaaattttacactataaaacttaaggatcgaatcggattaggatcgggctttgtttctattcatttttgaactatagataagttagggctctaccaaattgtgaagagccatttggatcgcgatccattaccacccctactcgtagtcgtaagtttcgcttcggcgtgcttgctgctgctgttgcagctcgcaggagcgtcgcatgtcgtctacaactacaaggacctcg。

本发明所述扩增indel分子标记的pcr引物，根据seqidno.1和seqidno.2的序列设计而来，由seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列组成，其特征是，

mn1-f:5’-tgtgatatggcagctaagag-3’(seqidno.3)；

mn1-r:5’-cgaggtccttgtagttgtag-3’(seqidno.4)。

本发明还公开了一种应用上述分子标记引物鉴定玉米胚乳发育野生型基因mn1和突变体基因mn1(是否灌浆正常)的方法，其特征是，

(1)以待测玉米材料的基因组dna为模板，以上述seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列为引物进行pcr扩增；

(2)对步骤(1)得到的pcr产物，进行电泳分析，如果所得扩增产物仅为495bp的dna片段，待测玉米材料为具有mn1/mn1基因型且灌浆正常的材料；若所得扩增产物仅为661bp的dna片段，则待测玉米材料为具有mn1/mn1基因型且灌浆缺陷的材料；若所得扩增产物为495/661bp的两种dna片段，则待测玉米材料为具有mn1/mn1杂合基因型且灌浆正常的材料。

所述步骤(1)中的pcr扩增体系用pcrmix进行扩增，本实验所用pcrmix为南京诺唯赞生物科技公司的2×taqplusmastermix(dyeplus)，pcr反应体系为20μl，包括如下组分：

所述步骤(1)的pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；然后72℃过度延伸7min。

本发明具有的优点及有益效果：(1)本发明indel分子标记与玉米胚乳发育基因mn1连锁紧密，可用于鉴定植株中是否含有胚乳发育缺陷基因mn1，检测结果可靠、简单易行。(2)用本发明分子标记对带有胚乳发育基因mn1的材料进行鉴定，可以提高玉米胚乳发育性状的鉴定效率，节约成本。利用该分子标记，在植株发育的早期，排除含有胚乳发育缺陷基因mn1的植株，对玉米育种具有重要意义。

附图说明

图1为玉米胚乳发育突变体emp13和野生型植株籽粒灌浆的对比图。相比野生型，突变体emp13籽粒灌浆缺陷，标尺为2mm。

图2为玉米胚乳发育突变基因emp13的图位克隆示意图。

图3为玉米胚乳发育基因mn1连锁的indel分子标记在野生型和突变体emp13中的电泳图谱。图中wt为胚乳发育正常野生型植株；m为dnamarkerdl2000；emp13为胚乳发育缺陷植株。

图4为利用本发明indel分子标记检测f3分离群体中胚乳发育正常和缺陷材料中mn1基因的电泳图谱。图中m为dnamarkerdl2000；1-5为胚乳发育正常植株；6-10为胚乳发育正常植株，其中7、8为杂合基因型植株；11-15为胚乳发育缺陷植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：玉米胚乳发育突变体基因emp13的图位克隆

(1)作图群体的构建

本实验中所用的玉米胚乳发育缺陷突变体材料来源于山东省农业科学院玉米研究所，系研究人员从田间发现的自然突变体(图1)，该突变体的胚乳发育缺陷表型由单隐性核基因控制，发明人将该突变体命名为emp13。

以上述胚乳发育突变体emp13为母本，以自交系mo17为父本杂交，得到f1代；f1代自交得到f2代，即为性状分离群体。鉴定f2代分离群体中籽粒胚乳发育缺陷的种子，萌发后提取叶片基因组dna，用于基因定位。玉米叶片基因组dna采用ctab法提取。

(2)多态性引物筛选及目标基因初定位

前期工作通过筛选突变体emp13与mo17之间具有多态性的ssr标记，得到152对均匀覆盖于玉米10条染色体上的多态ssr标记。以这些多态性ssr标记为引物，对f2代分离群体中的野生型混合池(20株胚乳发育正常植株的混合dna)和突变型混合池(20株胚乳发育缺陷植株的混合dna)进行pcr分析，以及对252个f2代分离群体中籽粒胚乳发育缺陷单株进行pcr，pcr产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，读取条带进行基因的连锁分析，初步将emp13基因定位于第2染色体上的两个ssr标记umc2030和umc2125之间，两个位置交换单株数分别是4和11(图2)

(3)emp13基因的精细定位

为进一步精细定位emp13基因，首先进一步扩大f2定位群体到2240株胚乳发育缺陷单株。其次根据已公开的b73与mo17之间的插入(insertion)和删除(deletion)多态标记，设计并筛选到标记umc2030和umc2125之间的13对多态indel标记，通过多态性标记对2240株胚乳发育缺陷单株的群体连锁分析发现，其中5个距离目标基因最近的标记分别是idp1，idp2，idp3，idp4和idp5，其交换单株数分别是7，6，2，1和0(图2)。最终确定emp13基因位于标记idp3和idp4之间的约1mb的区间内，共包含10个候选基因(图2)。

实施例2：玉米胚乳发育基因mn1的分子标记引物设计

对定位区间内10个候选基因在野生型和胚乳发育缺陷植株emp13之间的测序比较分析，发现区间内mn1基因的第一个外显子(atg下游18bp处)发生166bp序列插入(图2)，即emp13突变基因为mn1基因的等位突变基因。在此插入序列两端设计引物，获得野生型与突变体emp13之间的多态indel标记。引物序列如下，

mn1-f:5’-tgtgatatggcagctaagag-3’(seqidno.3)；

mn1-r:5’-cgaggtccttgtagttgtag-3’(seqidno.4)。

用设计的引物进行pcr扩增。pcr反应体系为：

pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；然后72℃过度延伸7min。

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，在胚乳发育正常的野生型植株中，所得扩增产物为495bp的dna片段，而在胚乳发育缺陷的emp13植株中，扩增产物为661bp的dna片段，标记在两个亲本间扩增条带单一，多态清晰。

实施例3：本发明玉米胚乳发育隐性核基因mn1的分子标记验证试验

取实例1中f2分离群体中胚乳发育正常和缺陷的籽粒分别自交一代，得到f3代玉米棒子，取玉米棒子上籽粒无分离且胚乳发育正常的籽粒、玉米棒子上有分离且胚乳发育正常的籽粒和玉米棒子上籽粒无分离且发育缺陷的籽粒各5粒，萌发后提取叶片dna，利用以上引物进行pcr扩增。pcr反应体系及扩增程序见实例2。

pcr产物进行琼脂糖电泳(图4)，结果籽粒胚乳发育正常且无分离的植株中仅扩增出495bp的dna片段，即为具有mn1/mn1基因型的材料；籽粒胚乳发育正常且表现出分离的植株中，扩增出495bp或495/661bp的dna片段，即为具有mn1/mn1或mn1/mn1基因型的材料；籽粒胚乳发育缺陷且无分离的植株中，仅扩增出661bp的dna片段，即为具有mn1/mn1基因型的材料。上述结果说明，该indel分子标记与籽粒胚乳发育性状紧密连锁，用本发明分子标记鉴定胚乳发育缺陷材料的mn1基因型准确、可靠，可以作为籽粒胚乳发育基因mn1的分子标记。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院玉米研究所

<120>玉米胚乳发育基因mn1紧密连锁的分子标记及应用

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<170>patentinversion3.3

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<223>与玉米胚乳发育野生型基因mn1检测相关的核苷酸序列

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<223>与玉米胚乳发育突变体基因mn1检测相关的核苷酸序列

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