本发明涉及一种芽孢杆菌，具体涉及一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其应用，属于农业微生物技术领域。
背景技术：
磷是植物生长过程中重要的营养元素。磷是核酸与核苷酸的组成成分，是组成细胞核和各种细胞器的重要元素，缺磷会影响植物细胞的分裂与形成，导致根系发育不良，植株生长缓慢乃至停滞。此外，磷是磷脂、腺三磷及许多酶的成分，是植物光合作用各个过程中的重要参与物质，缺磷时，叶片暗绿无光泽，植株矮小，抗性减弱，直接影响作物的产量与品质。
钾在植物生长发育过程中同样起着重要的作用。钾是许多酶的激活剂，调节植物气孔开闭及水分代谢，参与植物光合作用。钾元素可以增强植物的抗逆性。
土壤中含有丰富的难溶性磷、钾。土壤磷，按溶解度，可分为水溶性磷、枸溶性磷和难溶性磷，不易被作物吸收利用的难溶性磷约占全磷的99％，成为土壤磷的主要部分，致使土壤磷起不到相应的肥力效果。土壤中95％的钾是作物不能利用的矿物态钾。另外，农业生产中长期以来施用的磷肥主要是化学磷肥，而水溶态磷进入土壤后易发生化学固定或吸附固定，导致土壤中大量累积难以被植物吸收利用的磷素，大大降低磷肥利用率的同时也造成磷素污染。
因此，提供一种具有显著的溶磷解钾作用、可分解土壤中难溶性磷和钾转化为有效磷和钾、有效提高土壤肥力、改善土壤微生态环境、活化根际周围土壤菌群、促进植物生长的芽孢杆菌及其发酵液的制备与应用就成为该技术领域急需解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种具有显著的溶磷解钾作用、可分解土壤中难溶性磷和钾转化为有效磷和钾、有效提高土壤肥力、调节土壤酸碱度、改善土壤微生态环境、活化根际周围土壤菌群、促进植物生长的芽孢杆菌。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于：所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)lw-3，其保藏编号为cgmccno.16228；保藏日为2018年08月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明的另一目的是提供一种上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在制备纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在制备纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液中的应用。
本发明的再一目的是提供一种上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法，其步骤如下：
(1)种子活化：将低温保存的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3接种于lb固体培养基上培养，得到活化种子；
(2)液体种子培养：从步骤(1)得到的活化种子中，挑取单菌落接种于种子培养基中，得到种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，以1％-5％的接种量接入发酵培养基中培养，制得发酵液。
优选地，所述步骤(1)中所述lb固体培养基培养的具体条件是：32℃条件下培养24h。
优选地，所述步骤(2)中所述种子培养基培养的具体条件是：摇床转速180-200rpm，温度32-35℃，培养12-16h。
优选地，所述步骤(3)中所述发酵培养基培养的具体条件是：通气量0.5-1.5vvm，转速200-400rpm，温度32-35℃，培养时间24-30h。
优选地，所述步骤(3)中所述发酵培养基的组成为：豆粕粉20-40g/l，玉米淀粉20-38g/l，蔗糖15-30g/l，氯化钠2-4g/l，碳酸钙3-5g/l，磷酸二氢钾1-3g/l。
本发明的有益效果是：
本发明的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3具有显著的溶磷解钾作用，可分解土壤中的难溶性磷、钾，转化为有效磷、钾，有效提高土壤肥力，改善土壤微生态环境，活化根际周围土壤菌群，调节土壤，改良土壤活性，可有效减少化肥的使用量，促进作物良好生长，改善农产品品质。
下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅涉及本发明的优选实施方案，在不脱离本发明的精神和范围情况下，各种成分及含量的变化和改进都是可能的。
具体实施方式
实施例1
一、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的分离
将从广东江门古井采集土壤自然风干，研磨成粉得土壤样品；称取5g样品，溶于装有45ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，150rp振荡器振荡；振荡后成10-1倍的稀释液，将三角瓶置于80℃水浴，保持30分钟，然后用移液枪吸取1ml至装有9ml的无菌水试管中，充分振荡成10-2倍的稀释液，并依次稀释成10-5倍的稀释液；
配置溶磷解钾培养基，121℃灭菌30min，将稀释液取0.1ml，涂布于培养基上，然后放置于培养箱培养，观察产生有溶磷圈、溶钾圈的菌株，并挑取划线于营养琼脂(na)培养基上，再挑取单菌落，做溶磷、解钾效果试验，选取溶磷、解钾效果最好的菌株，备用；
二、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的鉴定
(1)纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的菌落形态及细胞形态
上述筛选的菌株，菌落淡黄色，近圆形，不透明，表面扁平，边缘不整齐；菌体杆状，可形成芽孢，革兰氏染色阳性；
(2)纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3生理生化特征见表1；
表1：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3生理生化特征
(3)纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3分子生物学特性
16srrna基因序列测定结果如下(如序列表中序列1所示)：
cttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacgactttatcggattagctccctctcgcgagttggcaaccgtttgtatcgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgatggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgttgcccccgaaggggaaaccatatctctacagtggtcaacgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagttacagaccagatagtcgccttcgccactggtgttcctccaaatctctacgcatttcaccgctacacttggaattccactatcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctaataaggtaccgtcaaggtacagccagttactactgtacttgttcttcccttacaacagagttttacgaaccgaaatccttcttcactcacgcggcgttgctccatcaggctttcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggcccatcctatagcgacagccgaaaccgtctttcagtgtttcaccatgaggtgaaacagattattcggtattagccccggtttcccggagttatcccaaactataaggtaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaacgtcgaaggagcaagctccttctctgttcgctcgacttgc
gyrb基因序列测定结果如下(如序列表中序列2所示)：
aatcaatctaaagagcctattcatgatcctattgatgtacttggagaaaaagatggtatctcggttgagattgctatgcaatataatgctggattctcttctaatattttttcatttgctaataacattaatacgtatgaaggtggtacacatgagtctggttttaaaacagctcttacacgcgtcattaatgattacgcacgaaaaggtggattattgaaagaagctgatgccaatttgacaggtgaggatgtccgtgaaggtttaacagccattgtctctgttaaacatccagatcctcaatttgaggggcaaacaaaaacaaagctagggaactcagaagtaagtcaaattactaacgctttattctcggatggctttgaacgatttatgttggaaaatccaactgttgctcgcaaagtagttgaaaaaggtttaatggcagctcgtgctcgtgtagcagccaaaaaggcccgtgagtttacacgtcgtaaaaatgcacttgaagtgtcaagcttgcctggtaaattggcggactgttcttcaacgaatccagctgaatgtgaaa
将上述测序结果在ncbi数据库中比对，与lysinibacillusfusiformis高度同源。
综合菌株的菌落及细胞形态、生理生化特征、16srrna基因序列、gyrb基因序列等实验数据分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，确定本发明菌种为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)lw-3。
三、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的保藏
将本发明菌种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3(lysinibacillusfusiformis)于2018年08月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.16228，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
四、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3解磷解钾能力的测定
(一)、培养基
解无机磷固体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，碳酸钙5g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g，琼脂粉15g，ph7.2，121℃灭菌30min。
解有机磷固体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，碳酸钙5g，氯化钾0.3g，卵磷脂0.3g，琼脂粉15g，ph7.2，121℃灭菌30min。
解钾固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钠1g，硫酸铵0.5g，硫酸镁1g，酵母膏0.2g，硫酸亚铁0.03g，碳酸钙2.5g，钾长石粉10g，琼脂粉15g，ph7.2，121℃灭菌30min。
种子培养基：玉米淀粉3g，蔗糖1.2g，硫酸铵0.48g，硫酸镁1.2g，磷酸氢二钾1.2g，氯化铁0.12g，碳酸钙1.2g，酵母粉0.6g，水1000ml，ph7.2。
解无机磷液体培养基：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水硫酸亚铁0.03g，酵母粉0.5g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。
解有机磷液体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，氯化钾0.2g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，卵磷脂0.3g，碳酸钙5g，酵母粉0.4g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。
解钾液体培养基：蔗糖10g，七水硫酸镁0.5g，硫酸铵0.2g，氯化钠0.1g，碳酸钙0.1g，钾长石粉5g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌30min。
(二)、解磷能力测定
采用溶磷圈法和钼锑抗比色法分别测定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的溶磷性能和解磷能力的强弱。
(1)溶磷圈法
将低温保存的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3接种于营养琼脂上，划线培养活化，32℃下培养24h；将活化的菌株分别点接在上述解无机磷固体培养基和解有机磷固体培养基上，设置3个重复，于32℃培养箱中培养5天，使用十字交叉法测量并记录溶磷圈直径。
(2)钼锑抗比色法
a.种子液制备
挑取一环活化好的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3菌种接入50ml种子培养基中，150r/min、30℃摇床培养到对数期，菌体含量不少于2×108cfu/ml；
b.发酵液制备
500ml三角瓶分别加入上述解无机/有机磷液体培养基95ml，121℃灭菌30min备用；向已灭菌的无机/有机磷液体培养基中接入纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3种子液5ml，以等量灭活种子液为对照，设置三个重复，于30℃、150r/min条件下培养5天，制得发酵液；
c.发酵液的处理－过氧化氢灰化法
将全部发酵液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10ml左右，加入2.0ml20％h2o2溶液，继续蒸发并不断搅动，如此反复至粘性物质完全消化；将溶液转移到离心管中3500r/min离心10min，将上清液收集到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，钼锑抗比色法测定溶液中的磷含量；
根据速效磷相对增加量衡量菌种的解磷能力：
速效磷相对增加量(％)＝[试验组速效磷的含量(mg/l)－对照组速效磷的含量(mg/l)]/试验组速效磷的含量(mg/l)×100％
纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3解磷能力试验结果见表2；
表2：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3解磷能力试验结果
(三)、解钾能力测定
采用解钾圈法和火焰光度计法分别测定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3的解钾性能和解钾能力的强弱；
(1)解钾圈法
将低温保存的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3接种于营养琼脂上，划线培养活化，32℃下培养24h；将活化的菌株分别点接在上述解钾固体培养基上，设置3个重复，于32℃培养箱中培养5天，使用十字交叉法测量并记录解钾圈直径；
(2)火焰光度计法
a.种子液制备
挑取一环活化好的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3菌种接入50ml种子培养基中，150r/min、30℃摇床培养到对数期，菌体含量不少于2×108cfu/ml；
b.发酵液制备
500ml三角瓶分别加入上述解钾液体培养基95ml，121℃灭菌30min备用。向已灭菌的解钾液体培养基中接入纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3种子液5ml，以等量灭活种子液为对照，设置三个重复，于30℃、150r/min条件下培养5天，制得发酵液；
c.发酵液的处理－过氧化氢灰化法
将全部发酵液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10ml左右，加入2.0ml20％h2o2溶液，继续蒸发并不断搅动，如此反复至粘性物质完全消化。将溶液转移到离心管中3500r/min离心10min，将上清液收集到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，然后用火焰光度计法测定溶液中速效钾含量；
d.速效钾的测定
先绘制kci标准曲线，再测定待测溶液速效钾含量。具体操作：吸取100μg/ml钾标准溶液0，5.00，10.00，15.00，20.00ml分别置于5个50ml容量瓶中，加10.0ml浓度为1mol/l的硝酸溶液，用水定容；此溶液为1ml含钾(k)0，10.00，20.00，30.00，40.00μg的标准溶液系列，记录仪器示值，根据钾浓度和仪器示值绘制校准曲线或求出直线回归方程，将步骤c制备的溶液与标准溶液系列同条件上机测定，由校准曲线或求出直线回归方程求得待测溶液中速效钾含量；
根据速效钾相对增加量衡量菌种的解钾能力：
速效钾相对增加量(％)＝[试验组速效钾的含量(mg/l)－对照组速效钾的含量(mg/l)]/试验组速效钾的含量(mg/l)×100％
(3)纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3解钾能力试验结果见下表3：
表3纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3解钾能力试验结果
五、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的促生长试验
(一)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备
(1)菌种的活化
将低温保存的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3接种于lb固体培养基上，32℃培养箱中恒温培养24h；
(2)液体种子培养
配置种子培养基(lb液体培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，水1000ml，ph7.2)，装液量为50ml/250ml三角瓶，高温蒸汽灭菌备用；挑取活化的种子中单菌落接种于已灭菌种子培养基中，摇床转速180-200rpm，温度32-35℃，培养12-16h；
(3)发酵液制备
经单因素试验和正交试验优化，发酵培养基组成为：豆粕粉40g/l，玉米淀粉38g/l，蔗糖40g/l，氯化钠3g/l，碳酸钙5g/l，磷酸二氢钾3g/l；将培养好的种子液以1％-5％的接种量接入发酵培养基中，培养条件为通气量0.5-1.5vvm，转速200-400rpm，温度32-35℃，培养时间24-30h，制得纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3发酵液；
(4)发酵液菌量测定
采用稀释涂布平板法测定发酵液菌量。
(二)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液对黄瓜的促生长实验
将黄瓜种子于育苗床育苗一周后，挑取生长一致的黄瓜幼苗移栽于装好土壤的杯子中，每杯一株幼苗。在黄瓜幼苗移栽后第4天，以淋施法向黄瓜幼苗茎基部浇淋200倍稀释液既10-6的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3发酵液，30ml/株，以等量清水为对照，发酵液处理与清水处理各16株黄瓜幼苗，于环境温度25-30℃，空气湿度50％-80％以上，温室光照时间为9h/天，光源为全光谱led灯，光强8000lx条件下栽培，每天定量浇水一次。处理后21天，分别测量各黄瓜植株的高度(茎基部到生长点的距离)、茎粗(距地面1cm处)、第一片真叶长度和宽度；实验结果见下表4；
表4：实验结果展示
从表4可以看出，与对照组相比，经纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3发酵液处理的黄瓜植株株高、叶长及叶宽均明显增加；其中，株高比对照组增加22.85％，茎粗比对照组增加23.53％，叶长比对照组增加35.02％，叶宽比对照组增加34.59％。
本发明的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lw-3具有溶磷解钾作用，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液可有效减少化肥的使用量，改良土壤环境，促进植物良好生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>广东植物龙生物技术股份有限公司
<120>纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1424
<212>dna
<213>纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformislw-3)
<400>1
cttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtgg60
tgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcga120
ttactagcgattccggcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacga180
ctttatcggattagctccctctcgcgagttggcaaccgtttgtatcgtccattgtagcac240
gtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggt300
ttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgatggcaactaagatcaagggtt360
gcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcacc420
acctgtcaccgttgcccccgaaggggaaaccatatctctacagtggtcaacgggatgtca480
agacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcg540
ggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgctt600
aatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgttta660
cggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgt720
cagttacagaccagatagtcgccttcgccactggtgttcctccaaatctctacgcatttc780
accgctacacttggaattccactatcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatga840
ccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcgctt900
tacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgt960
agttagccgtggctttctaataaggtaccgtcaaggtacagccagttactactgtacttg1020
ttcttcccttacaacagagttttacgaaccgaaatccttcttcactcacgcggcgttgct1080
ccatcaggctttcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctggg1140
ccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgcctt1200
ggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggcccatcctatagcgacagcc1260
gaaaccgtctttcagtgtttcaccatgaggtgaaacagattattcggtattagccccggt1320
ttcccggagttatcccaaactataaggtaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccg1380
ctaacgtcgaaggagcaagctccttctctgttcgctcgacttgc1424
<210>2
<211>568
<212>dna
<213>纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformislw-3)
<400>2
aatcaatctaaagagcctattcatgatcctattgatgtacttggagaaaaagatggtatc60
tcggttgagattgctatgcaatataatgctggattctcttctaatattttttcatttgct120
aataacattaatacgtatgaaggtggtacacatgagtctggttttaaaacagctcttaca180
cgcgtcattaatgattacgcacgaaaaggtggattattgaaagaagctgatgccaatttg240
acaggtgaggatgtccgtgaaggtttaacagccattgtctctgttaaacatccagatcct300
caatttgaggggcaaacaaaaacaaagctagggaactcagaagtaagtcaaattactaac360
gctttattctcggatggctttgaacgatttatgttggaaaatccaactgttgctcgcaaa420
gtagttgaaaaaggtttaatggcagctcgtgctcgtgtagcagccaaaaaggcccgtgag480
tttacacgtcgtaaaaatgcacttgaagtgtcaagcttgcctggtaaattggcggactgt540
tcttcaacgaatccagctgaatgtgaaa568