一种重组人铁蛋白分离纯化方法与流程

本发明涉及蛋白质分离纯化的技术领域，特别是一种重组人铁蛋白分离纯化方法的技术领域。

背景技术：

铁蛋白(ferritin)广泛存在于各种生物体内，由24个亚基自发组成，笼状蛋白复合体结构，是一种天然的高分子生物材料。其在生物体内具有储存铁元素、抗氧化等功能，但作为一种天然的高分子材料，也可做为纳米载体广泛用于药物输送、医学成像等，同时铁蛋白可以与在肿瘤细胞内高效表达的转铁蛋白受体结合用于肿瘤的诊断与治疗。铁蛋白可用转基因技术在大肠杆菌内得到高效表达，然后进行菌体细胞破碎实现蛋白的分离纯化。传统的铁蛋白分离纯化方法大多采用沉淀法，包括乙醇沉淀、利凡诺沉淀和硫酸铵沉淀，但采用沉淀法制得的铁蛋白相对纯度和回收率都较低，后逐渐采用层析法取代沉淀法，通过离子交换层析和疏水层析等层析方式对铁蛋白进行分离纯化。但现有的一些层析法存在回收率低，每步层析都需要进行脱盐稀释操作较为繁琐不利于大规模生产，铁蛋白的纯度还不能达到医疗用品的级别。

技术实现要素：

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种重组人铁蛋白分离纯化方法，能够使铁蛋白分离纯化方法操作简便可适合大规模生产，蛋白回收率高，纯度高。

为实现上述目的，本发明提出了一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：

1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；

2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；

3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；

4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。

作为优选，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mmpb或trisph7.0，所述步骤1)中加热的温度范围和时间分别为70-75℃、5-15min，所述步骤1)中过滤处理采用0.22um中空纤维或滤膜过滤处理方式。

作为优选，所述步骤2)具体为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用0.5mnaoh处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5mnaoh清洗结合能力比较强的杂质，用10mmnaoh保存层析柱。

作为优选，所述步骤2)中阴离子层析介质为qbestarosehighperformance、qsepharosehighperformance、deaebestarosehighperformance、deaesepharosehighperformance、sourceq、qbestarosefastflow、qsepharosefastflow、deaebestarosefastflow、deaesepharosefastflow、qbestarosebigbeads、qsepharosebigbeads、qbestarosebigbeads、qsepharosebigbeads、diamondq、captoq、diamondqmustang、captoqmustang、captodeae、diamonddeae或diamonddeaemustang中的一种；所述步骤2)中结合缓冲液为5-100mmpb或trisph7.0；所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mmpb或mesph6.0或5-100mmpb或tris0.1mnaclph7.0中的一种；所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mmnaacph4.5或5-100mmpb0.25mnaclph7.0；所述步骤2)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与结合缓冲液的ph和电导保持一致。

作为优选，所述步骤3)具体为；取装有阳离子层析介质的层析柱，用0.5mnaoh处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5mnaoh清洗结合能力比较强的杂质，用10mmnaoh保存层析柱。

作为优选，所述步骤3)中阳离子层析介质为spbestarosehighperformance、spsepharosehighperformance、diamondmmc、captommc、diamondmmcmustang、captommcimpres、spbestarosefastflow、spsepharosefastflow、captospimpres、diamondspmustang、cmbestarosefastflow或cmsepharosefastflow中的一种；所述步骤3)中结合缓冲液为5-100mmnaacph5.0或5-100mmnaac0.2mnaclph5.0；所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mmpb0.01mnaclph6.0或5-100mmpbph6.0；所述步骤3)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与结合缓冲液的ph和电导保持一致。

作为优选，所述步骤4)具体为；取装有疏水层析介质的层析柱，用0.5mnaoh处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用纯水洗脱杂质，用0.5mnaoh清洗层析柱，用10mmnaoh保存层析柱。

作为优选，所述步骤4)中疏水层析介质为butylbestarosehighperformance、butylsepharosehighperformance、diamondbutylmustang、captobutylimpres、butylbestarosefastflow、phenylsepharosefastflowhs、phenylsepharosefastflowls、phenylbestarosefastflowhs、phenylbestarosefastflowls、butylsepharosefastflow、diamondbutyl、captobutyl、captophenylhs、captophenylimpres、diamondphenylmustang或diamondphenyl中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液为5-100mmpb或tris0.8-2mna2so4ph7.0、5-100mmpb或tris1.5-3mnaclph7.0、5-100mmpb或tris0.8-2.5m(nh4)2so4ph7.0或5-100mmpb或tris0.8-2mk2hpo4ph7.0中的一种；所述步骤4)中洗脱缓冲液为5-100mmpb或tris0.2-0.5mna2so4ph7.0、5-100mmpb或tris0.8-1.2mnaclph7.0、5-100mmpb或tris0.4-0.8m(nh4)2so4ph7.0、5-100mmpb或tris0.4-0.8mk2hpo4ph7.0中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与结合缓冲液的ph和电导保持一致。

作为优选，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)均需进行蛋白指标检测。

作为优选，所述蛋白指标指标检测采用凝胶过滤检测和离子色谱检测方式。

本发明的有益效果：本发明采用阴离子层析、阳离子层析和疏水层析三步层析方式制得的铁蛋白纯度和回收率高，纯度≥97％，可达到医疗用品级别，每步层析间不需要进行繁琐的脱盐稀释操作，方法操作简便，适合大规模生产，通过采用凝胶过滤检测和离子色谱检测对每步层析洗脱样品进行检测，增加铁蛋白分离纯化方法的可靠性。

本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤1)过程的凝胶过滤检测图；

图2是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤2)阴离子层析处理过程凝胶过滤检测图；

图3是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤3)阳离子层析处理过程凝胶过滤检测图；

图4是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例1的步骤4)疏水层析处理过程凝胶过滤检测图；

图5是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤1)过程凝胶过滤检测图；

图6是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤2)阴离子层析处理过程凝胶过滤检测图；

图7是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤3)阳离子层析处理过程凝胶过滤检测图；

图8是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的实施例2的步骤4)疏水层析处理过程凝胶过滤检测图；

图9是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的三步层析处理前滤液样品的离子检测图；

图10是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的三步层析处理后样品的离子检测图；

图11是本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法的空白离子检测对照图。

【具体实施方式】

实施例1，本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：

1)将10g大肠杆菌发酵液离心后得到菌泥，菌泥按质量体积比为1:10加入20mmpbph7.0,搅匀后,800bar环境下高压匀浆破碎两遍，加热至72℃并恒定加热5min,12000g离心作用下离心处理10min，之后去上清，用0.22um滤膜过滤，得到滤液，对滤液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测；

2)阴离子层析处理：取30ml阴离子层析介质qbestarosehighperformance，装到bxk16/20层析柱中，以下层析过程均在akta蛋白纯化仪上进行，用0.5mnaoh处理阴离子层析介质，再用120ml结合缓冲液50mmpbph7.0平衡层析柱至与基线持平位置，取100ml的按步骤1)得到的滤液调ph至7.0，上样，用100ml清洗缓冲液25mmpbph6.0清洗杂质，用100ml洗脱缓冲液50mmpb0.25mnaclph7.0洗脱目的铁蛋白并收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用40ml25mmpb1mnaclph7.0清洗杂质,之后用40ml0.5mnaoh清洗柱子，洗去未洗脱的结合杂蛋白，用10mmnaoh平衡保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阴离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为97％，回收率为76.8％，载量为30mg/ml；

3)阳离子层析处理：取适量阳离子层析介质spbestarosehighperformance装入bxk16/20，柱床高度为11.3cm，用40ml0.5mnaoh处理层析柱,用结合缓冲液50mmnaacph5.0平衡层析柱，取按步骤2)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品145ml，调ph至5.0，上样，用结合缓冲液清洗，用60ml洗脱缓冲液20mmpb0.01mnaclph6.0洗脱目的蛋白，用3cv纯水洗脱杂质后用3cvnaoh清洗柱子，10mmnaoh保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阳离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为97.7％，回收率为99.3％，载量为10mg/ml；

4)疏水层析处理：取适量疏水层析介质butylbestarosehighperformance装入bxk16/20，柱床高度为11cm，用40ml0.5mnaoh处理层析柱,用结合缓冲液20mmpb1.0mna2so4ph7.0平衡层析柱，取按步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品10ml，样品加na2so4调电导至与结合缓冲液的电导相同，调ph7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用洗脱缓冲液20mmpb0.5mna2so4ph7.0洗脱目的蛋白，用60ml纯水洗脱杂质后用60mlnaoh清洗柱子，10mmnaoh保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步疏水层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为98.7％，回收率为68.2％，载量为20mg/ml；

步骤1)参阅图1可获得滤液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.89min；

步骤2)参阅图2可获得采用阴离子层析介质qbestarosehighperformance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.92min；

步骤3)参阅图3可获得采用阳离子层析介质spbestarosehighperformance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.85min；

步骤4)参阅图4可获得采用疏水层析介质butylbestarosehighperformance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.96min。

实施例2，本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：

1)将10g大肠杆菌发酵液离心后得到菌泥，菌泥按质量体积比为1:10加入20mmpbph7.0,搅匀后,800bar环境下高压匀浆破碎两遍，加热至72℃并恒定加热5min,12000g离心作用下离心处理10min，之后去上清，用0.22um滤膜过滤，得到滤液，对滤液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测；

2)阴离子层析处理：取40ml阴离子层析介质deaebestarosehighperformance，装到bxk16/20层析柱中，以下层析过程均在akta蛋白纯化仪上进行，用0.5mnaoh处理阴离子层析介质，再用120ml结合缓冲液50mmpbph7.0平衡层析柱至与基线持平位置，取100ml的按步骤1)得到的滤液调ph至7.0，上样，用100ml清洗缓冲液50mmpb0.1mnaclph7.0清洗杂质，用120ml洗脱缓冲液50mmpb0.25mnaclph7.0洗脱目的铁蛋白并收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用40ml的50mmpb1mnaclph7.0清洗杂质,之后用40ml0.5mnaoh清洗柱子，洗去未洗脱的结合蛋白，用10mmnaoh平衡保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阴离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为76.48％，回收率为80％，载量为30mg/ml；

3)阳离子层析处理：取适量阳离子层析介质diamondmmcmustang装入bxk16/20，柱床高度为13cm，用40ml0.5mnaoh处理层析柱,用结合缓冲液20mmnaac0.2mnaclph5.0平衡层析柱，取按步骤2)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品145ml，样品用纯水稀释至和结合缓冲液电导相同，调ph至7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用40ml洗脱缓冲液20mmpbph6.0洗脱目的蛋白，用40ml的naoh清洗柱子，10mmnaoh保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步阳离子层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为94％，回收率为88.6％，载量为20mg/ml；

4)疏水层析处理：取适量疏水层析介质phenylbestarosefastflowhs装入bxk16/20，柱床高度为10.5cm，用40ml0.5mnaoh处理层析柱,用结合缓冲液20mmpb2mnaclph7.0平衡层析柱，取按步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液样品10ml，样品加nacl调电导至与结合缓冲液的电导相同，调ph7.0，上样，用结合缓冲液清洗，用洗脱缓冲液20mmpb1mnaclph7.0洗脱目的蛋白，用60ml纯水洗脱杂质后用60mlnaoh清洗柱子，10mmnaoh保存层析柱，对含铁蛋白的洗脱缓冲液进行凝胶过滤检测和离子色谱检测，该步疏水层析得到含铁蛋白的洗脱缓冲液中目的蛋白纯度为98.47％，回收率为61％，载量为17.76mg/ml；

步骤1)参阅图5可获得滤液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.89min；

步骤2)参阅图6可获得采用阴离子层析介质deaebestarosehighperformance的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.86min；

步骤3)参阅图7可获得采用阳离子层析介质diamondmmcmustang的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为27.91min；

步骤4)参阅图8可获得采用疏水层析介质phenylbestarosefastflowhs的洗脱缓冲液样品凝胶过滤检测目的蛋白出峰时间为28.04min。

本发明一种重组人铁蛋白分离纯化方法，本发明采用阴离子层析、阳离子层析和疏水层析三步层析方式制得的铁蛋白纯度和回收率高，参阅图9至11，离子检测图中主峰变大，杂峰越来越小，纯度≥97％，可达到医疗用品级别，每步层析间不需要进行繁琐的脱盐稀释操作，方法操作简便，适合大规模生产，通过采用凝胶过滤检测和离子色谱检测对每步层析洗脱样品进行检测，增加铁蛋白分离纯化方法的可靠性。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。