一种检测A型塞内卡病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种检测a型塞内卡病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒。本发明属于兽医生物诊断技术领域。

背景技术：

a型塞内卡病毒(senecavirusa，sva)近年来在许多国家和地区引起了水疱性疾病，作为一种新的致病因子，与口蹄疫相似，可以造成很大的经济损失，2015年后，在美国、巴西和中国逐渐爆发，造成了不小的经济损失，但是诊断方法和商业化的疫苗却迟迟未见开发或研究迟缓。随后传入中国以来2015-2016年呈散发，2017年以来，sva先后在福建、广东、广西、河南(11个县区)、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病。

sva是小核糖核酸病毒科内唯一属于塞内卡病毒属，小核糖核酸病毒家族，具有所有小核糖核酸病毒共有的一些特征。病毒为无囊膜的单股正链rna病毒。病毒呈典型的二十面体对称和约7.2kb的线性单链核糖核酸(rna)基因组，直径为27nm左右。sva基因组长约7.2kb，包含一个独特的开放阅读框架(orf)，其两侧为5’和3’非翻译区(utr)，3-utr后面是poly(a)尾巴。

a型塞内卡病例的诊断主要依靠流行病学、临床特征和实验室检查三方面的证据。实验室检查包括pcr、间接免疫荧光、酶联免疫吸附实验和病毒分离等方法。然而，这些主要针对抗体的检测方法均不能在疾病早期提供有力的诊断证据。特别是，上述方法均需测定并比较急性期和恢复期的血清抗体滴度，时间跨度长，不利于宿主的早期诊断和治疗。rt-rcr方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使用受到限制。

实时荧光定量pcr技术是上世纪90年代中期基于传统的pcr技术发展起来的。与传统的pcr技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数寡核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。实时荧光pcr技术通过对扩增曲线以及循环阈值(ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光pcr是将dna扩增与检测过程融合为一体动态检测dna扩增的全过程，省掉了pcr后处理过程，大大缩短了结果分析时间，快捷、方便。由于实时荧光pcr采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的pcr方法，得到十分广泛的应用。

荧光定量pcr的检测模式之一为sybrgreeni检测模式。sybrgreeni是一种能与双链dna结合发光的荧光染料。其与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，sybrgreeni的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出pcr体系存在的双链dna数量，通用性好，并且价格相对较低。由于sybrgreeni与所有的双链dna相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异性产物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由sybrgreeni得到定量结果。

郑海学等人曾利用taqman探针荧光定量pcr方法检测a型塞内卡病毒(公开号：cn108384893a)。但taqman探针荧光定量pcr检测方法成本太高，不利用广泛使用。另外，taqman探针荧光定量pcr检测方法基于扩增过程中靶序列的存在而发出报告基因的荧光信号，而不同地域的a型塞内卡病毒核酸序列并不十分一致，如果靶序列发生突变，taqman探针荧光定量pcr检测方法将失去意义。因此，sybrgreeni荧光定量pcr检测方法更适于a型塞内卡病毒所有变异体的检测和定量分析。

技术实现要素：

本发明旨在提出一种检测a型塞内卡病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒，该引物及试剂盒能够在生物样品中快速检测各种a型塞内卡病毒rna拷贝数，具有价格实惠、准确性好、灵敏度高、重复性强，使用方便等优点。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种检测a型塞内卡病毒(senecavirusa，sva)的荧光定量pcr引物，所述的引物是基于塞内卡病毒l/vp4区段基因序列设计的，其上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示。

进一步，本发明还提供了所述的荧光定量pcr引物在制备检测a型塞内卡病毒试剂中的用途。

一种检测a型塞内卡病毒的荧光定量pcr试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测a型塞内卡病毒(senecavirusa，sva)的荧光定量pcr引物，所述的引物是基于塞内卡病毒l/vp4区段基因序列设计的，其上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有rna抽提试剂、逆转录反应液、荧光定量pcr反应液以及标准阳性dna模版。

其中，优选的，所述的rna抽提试剂为trizol试剂，所述的逆转录反应液为5×primescriptrtmastermix，所述的荧光定量pcr反应液为tbgreen^tmpremixextaq^tm(tlirnasehplus)，所述的标准阳性dna模版是将seqidno.6所示的l/vp4基因片段连接到peasy-blunt载体上得到。

其中，优选的，标准阳性dna模版的浓度分别为6.4×10¹⁰拷贝数/μl、6.4×10⁹拷贝数/μl、6.4×10⁸拷贝数/μl、6.4×10⁷拷贝数/μl、6.4×10⁶拷贝数/μl、6.4×10⁵拷贝数/μl和6.4×10⁴拷贝数/μl。

其中，优选的，使用所述的荧光定量pcr试剂盒进行荧光定量pcr扩增时，荧光定量pcr反应体系包括：荧光定量pcr反应液12.5μl，a型塞内卡病毒cdna2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，depc水补足至25μl；

荧光定量pcr反应条件：95℃5秒，95℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、目前研究表明，塞内卡病毒vp2中含有重要的抗原位点，能够引起宿主的体液以及细胞免疫应答，但变异位点较多，不能用于不同地区来源的a型塞内卡病毒的检测。本发明通过blast序列比对，发现l/vp4区段基因序列可以检测美国、巴西和中国等多个国家的流行毒株，具有很好的保守性，于是本发明基于塞内卡病毒l/vp4区段基因序列设计了一对引物，该引物可用于各个地区流行的a型塞内卡病毒的检测。

2、实验证明，采用本发明的引物和试剂盒检测a型塞内卡病毒具有准确性好、灵敏度高、重复性强，使用方便的特点。

3：本发明的试剂盒具有价格实惠，易于推广，能够方便实验室和工厂使用。

附图说明

图1为本发明引物与多个国家的sva流行毒株的序列比对结果；

图2为以标准阳性dna为模板进行的荧光定量pcr扩增；

a：扩增曲线；b：标准曲线；c：溶解曲线；其中1-7：每个重复3次，6.4×10¹⁰拷贝数/μl、6.4×10⁹拷贝数/μl、6.4×10⁸拷贝数/μl、6.4×10⁷拷贝数/μl、6.4×10⁶拷贝数/μl、6.4×10⁵拷贝数/μl和6.4×10⁴拷贝数/μl；8：ntc(无模板对照)

图3为特异性实验结果；

a：扩增曲线；b：溶解曲线；

图4为灵敏度实验结果；

a：扩增曲线；b：溶解曲线；其中1-11：6.4×10¹⁰拷贝数/μl、6.4×10⁹拷贝数/μl、6.4×10⁸拷贝数/μl、6.4×10⁷拷贝数/μl、6.4×10⁶拷贝数/μl、6.4×10⁵拷贝数/μl、6.4×10⁴拷贝数/μl、6.4×10³拷贝数/μl、6.4×10²拷贝数/μl、6.4×10¹拷贝数/μl和6.4×10⁰拷贝数/μl；12：ntc(无模板对照)。

图5为按照alaismariadallagnol等人设计的sybrgreeni荧光定量pcr扩增结果；

a：扩增曲线；b：溶解曲线；其中1：ntc(无模板对照)，含有引物二聚体。

图6为根据veronical.fowler等人设计的荧光定量pcr扩增结果。

其中1-6：1×10⁸拷贝数/μl、1×10⁷拷贝数/μl、1×10⁶拷贝数/μl、1×10⁵拷贝数/μl、1×10⁴拷贝数/μl、1×10³拷贝数/μl；7：1×10²；8：1×10¹。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除有定义外，以下方法中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下方法中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1检测a型塞内卡病毒(sva)的荧光定量pcr方法的建立

1、引物设计

本发明发明人通过blast序列比对，发现sval/vp4区段基因序列在美国、巴西和中国等多个国家的sva流行毒株中均具有很好的保守性，因此，针对该序列，设计了一对可用于各个地区流行的a型塞内卡病毒检测的引物，其序列如下所示：

上游引物1：5’tggactggacatygtata3’(seqidno.1所示)；

下游引物1：5’ttgcgtagtaattgaaggt3’(seqidno.2所示)。

其扩增序列为：

tggactggacatygtatacgaactacaaggtaatgttcagacaacctcaaagaacgattttgattcccgcggcaataatggtaacatgaccttcaattactacgcaa(seqidno.3所示)。其中：y＝c/t。

经过序列比对发现，通过在l/vp4区段设计qpcr引物可以检测美国、巴西和中国，泰国，加拿大多个国家的流行毒株(图1)，如果设计为探针，将会导致检测成本增高，而且突变位点较多，容易导致探针失效。

2、标准阳性dna模版的制备

(1)a型塞内卡病毒rna的提取

培养的ibrs细胞接种病毒后一定时间，取100μl细胞培养上清，加到1mltrizol试剂中，摇匀，静置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒，然后以12000g常温离心15分钟。取上层溶液，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。12000g常温离心15分钟，小心倒掉液体。用1ml75％乙醇洗rna沉淀，12000g常温离心5分钟。小心倒掉液体，室温下晾干。rna溶于50μldepc处理的去离子水中。

(2)逆转录pcr扩增l/vp4基因片段

逆转录反应，制备a型塞内卡病毒cdna模版，逆转录反应条件如下：逆转录反应液8μl，rna溶液2μl，37℃反应15分钟，然后85℃反应5秒。

引物l/vp4基因片段上下游引物的核苷酸序列为：

上游引物2：5’gatgcatgctcgagcggcc3’(seqidno.4所示)；

下游引物2：5’aacggccgccagtgtgctgg3’(seqidno.5所示)；

pcr反应组成：a型塞内卡病毒cdna模版2μl，10×pcr缓冲液5μl，去离子水36μl，10×dntp5μl，上游引物20.5μl，下游引物20.5μl，taqdna聚合酶1μl。

pcr反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟共30个循环；72℃5分钟。

(3)琼脂糖凝胶电泳纯化回收上述pcr反应扩增得到的l/vp4基因片段(seqidno.6所示)，按如下条件连接到peasy-blunt载体上：peasy-blunt1μl，10×t4dna连接酶缓冲液1μl，l/vp4基因片段7μl，t4dna连接酶1μl，4℃反应过夜。

(4)连接产物转化dh5a感受态细胞，挑阳性克隆培养，提质粒，测序正确的克隆质粒命名为peasy-l/vp4。

(5)标准阳性dna模版的制备：将质粒peasy-l/vp4配成浓度分别为6.4×10¹⁰拷贝数/μl、6.4×10⁹拷贝数/μl、6.4×10⁸拷贝数/μl、6.4×10⁷拷贝数/μl、6.4×10⁶拷贝数/μl、6.4×10⁵拷贝数/μl和6.4×10⁴拷贝数/μl的水溶液，即为试剂盒中的标准阳性dna模版。

3、a型塞内卡病毒的荧光定量pcr方法的建立

(1)a型塞内卡病毒rna的提取

培养的ibrs细胞接种病毒后一定时间，取100μl细胞培养上清，加到1mltrizol试剂中，摇匀，静置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒，然后以12000g常温离心15分钟。取上层溶液，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。12000g常温离心15分钟，小心倒掉液体。用1ml75％乙醇洗rna沉淀，12000g常温离心5分钟。小心倒掉液体，室温下晾干。rna溶于50μldepc处理的去离子水中。

(2)逆转录反应

制备a型塞内卡病毒cdna模版，逆转录反应条件如下：逆转录反应液5×primescriptrtmastermix8μl，rna溶液2μl，37℃反应15分钟，然后85℃反应5秒。

(3)荧光定量pcr反应

配置荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr反应液tbgreen^tmpremixextaq^tm(tlirnasehplus)12.5μl，逆转录产物2μl，上游引物11μl，下游引物11μl，depc水补足至25μl。

荧光定量pcr反应条件：95℃5秒，95℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

(4)制作标准曲线

配置荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr反应液tbgreen^tmpremixextaq^tm(tlirnasehplus)12.5μl，标准阳性dna模版2μl，上游引物11μl，下游引物11μl，depc水补足至25μl。

荧光定量pcr反应条件：95℃5秒，95℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

以log(模板拷贝数)为横坐标，循环数ct值为纵坐标绘制标准曲线，所得标准曲线方程为：y＝-3.278+42.671r2＝0.997(表明线性关系良好)e＝101.9％，如图2所示。模板拷贝数与循环数ct值对应关系如表1所示：

表1模板拷贝数与循环数ct值对应关系

溶解曲线是判断扩增产物是否单一的曲线，出现其他峰就该考虑是否为引物二聚体(一般为60～75℃之间)，或者为基因组dna污染的峰(在90℃以后)。如图2所示，溶解曲线为单一峰，在75℃之后出现a型塞内卡病毒l/vp4基因的特征溶解曲线，说明无其他污染和引物二聚体。

4、特异性实验

利用实验3的方法分别对a型口蹄疫病毒cdna、o型口蹄疫病毒cdna、猪瘟病毒cdna，a型塞内卡病毒阳性对照品进行实时荧光pcr检测，仅a型塞内卡病毒cdna为阳性，其余均为阴性(图3)。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地、特异地将a型塞内卡病毒检测出来。

5、灵敏度实验

取阳性对照品(即构建好的克隆质粒peasy-l/vp4)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取6.4×10¹⁰～6.4×10⁰拷贝/μl的浓度作为样品进行灵敏度实验，用本发明的试剂盒和检测方法进行检测。

如图4所示检测结果表明，本发明方法对a型塞内卡病毒的最低检出限浓度为6.4×10⁰拷贝/μl；10倍梯度稀释的标准曲线，斜率为3.278，相关系数r²为0.997，灵敏度高。

6、重复性试验

取阳性对照品(即构建好的克隆质粒peasy-l/vp4)和阴性对照品(阴性对照模板为经过灭菌处理的ddh2o)，用上述检测方法进行重复性试验，每个标准品重复3次试验，检测结果显示阳性对照品ct值变异系数均小于5％，阴性对照品均无扩增。

实施例2检测a型塞内卡病毒(sva)的荧光定量pcr试剂盒的组装

试剂盒中的主要试剂：

rna抽提试剂：trizol试剂；

逆转录反应液：5×primescriptrtmastermix和depc水；

荧光定量pcr反应液：tbgreen^tmpremixextaq^tm(tlirnasehplus)和depc水

上游引物1：5’tggactggacatcgtata3’(seqidno.1所示)；

下游引物1：5’ttgcgtagtaattgaaggt3’(seqidno.2所示)。

标准阳性dna模版：质粒peasy-l/vp4的水溶液，浓度分别为6.4×10¹⁰拷贝数/μl、6.4×10⁹拷贝数/μl、6.4×10⁸拷贝数/μl、6.4×10⁷拷贝数/μl、6.4×10⁶拷贝数/μl、6.4×10⁵拷贝数/μl和6.4×10⁴拷贝数/μl；

其中，5×primescriptrtmastermix、tbgreen^tmpremixextaq^tm(tlirnasehplus)、trizol购自takara公司。

比较例1

本发明使用了文献已发表的关于靶向3d和vp1基因序列设计的基于taqman探针荧光定量pcr方法与本发明建立的方法进行比较。按照alaismariadallagnol等人设计了在vp1上的引物和探针序列和体系进行实验，我们通过实验发现，使用该序列设计的sybrgreeni体系会引起引物二聚体等非特异反应(图5)。进而我们又根据veronical.fowler等人基于3d序列设计的引物和探针进行了相关验证试验，发现虽然克服了引物二聚体的非特异扩增问题，但敏感性不强，只能探测到10³拷贝数/μl质粒浓度，并不能很好的检测到更低限量的病毒rna(图6)。我们并没有重复出发表文章所列的结果，而且其试剂成本过高。而采用本发明基于l/vp4序列设计的上下游引物进行扩增，在灵敏度，特异性和成本方面都拥有比前人更好的结果。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种检测a型塞内卡病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒

<130>klpi181061

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>mutation

<223>n=c/t

<400>1

tggactggacatngtata18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

ttgcgtagtaattgaaggt19

<210>3

<211>107

<212>dna

<213>senecavirusa

<220>

<221>mutation

<223>n=c/t

<400>3

tggactggacatngtatacgaactacaaggtaatgttcagacaacctcaaagaacgattt60

tgattcccgcggcaataatggtaacatgaccttcaattactacgcaa107

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

gatgcatgctcgagcggcc19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

aacggccgccagtgtgctgg20

<210>6

<211>1364

<212>dna

<213>senecavirusa

<400>6

gatgcatgctcgagcggccgccagtgtgatggatatctgcagaattgccctttttgaaat60

ggggggctgggccctcatgcccagtccttcctttccccttccggggggtaaaccggctgt120

gtttgctagaggcacagaggagcaacatccaacctgcttttgtggggaacggtgcggctc180

caattcctgcgtcgccaaaggtgttagcgcacccaaacggcgcatctaccaatgctattg240

gtgtggtctgcgagttctagcctactcgtttctcccctactcactcatttacacacaaaa300

actgtgttgtaactacaagatttggccctcgcacgggatgtgcgacaaccgcaagattga360

ctcaagcgcggaaagcgctgtaaccacatgctgttagtccctttatggctgcgagatggc420

tatccacctcggatcactgaactggagctcgaccctccttagtaagggaaccgagaggcc480

ttcctgcaacaagctccgacacagagtccacgtgattgctaccaccatgagtacatggtt540

ctcccctctcgacccaggacttctttttgaatatccacggctcgatccagagggtggggc600

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gatactgcctgatagggcgacggcctagtcgtgtcggttctataggtagcacatacaaat720

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acaaaagtcaagatcgttgaataccccagatcggtgaacaatggtgtttacgattcgtcc840

actcatttagagatactgaacctacagggtgaaattgaaattttaaagtctttcaacgaa900

taccaaattcgcgccgccaaacaacaacttggactggacatcgtatacgaactacaaggt960

aatgttcagacaacctcaaagaacgattttgattcccgcggcaataatggtaacatgacc1020

ttcaattactacgcaaacacttaccagaattcagtagacttctcgacctcctcgtcggcg1080

tcaggcgccggacccgggaactcccggggcggattagcgggtctcctcacaaatttcagt1140

ggaatcttgaaccctcttggctacctcaaagatcacaataccgaagaaatggaaaactct1200

gctgatcgagtcataacgcaaacggcgggcaacactgccataaacacgcaatcatcactg1260

ggtgtgttgtgtgcctacgttgaagacccgaccaaatctgaccctccgtccagcagcaca1320

gatcaacccaccacaagggcaattccagcacactggcggccgtt1364