一种基于微滴式数字PCR定量检测木薯成分的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒及其应用。

背景技术：

木薯(manihotesculentacrantz)是中国长江以南地区的作物，可耐受贫瘠的土地，适应性强。其淀粉含量高，可作为能源物质，也可生产木薯淀粉用于食品加工。由于其价格较低，常存在混入高价值淀粉产品中如红薯粉，马蹄粉等情况。因此，市场供应符合要求的货物，特别是对货值较大的贸易行为，需要灵敏度、精确度高的定量鉴定技术来完成鉴别，以维护市场公平和秩序。

由于淀粉类在物理外观上相似，很难肉眼区别。目前，有研究根据淀粉颗粒超微形貌上的差别，运用扫描电镜与稳定碳同位素比法鉴别木薯淀粉中掺假的玉米淀粉，或采用红外光谱技术、肽指纹图谱区等技术检测淀粉中掺杂木薯粉等。上述方法容易受到品种、收获季节等因素的影响，也容易受取样均匀性和代表性等限制，影响结果判断的准确性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用范围广、检测准确性灵敏度高的定量检测木薯成分的试剂盒及其应用。

本发明提供了一种基于微滴式数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒，包括msod2基因的上游引物、msod2基因的下游引物和msod2基因的探针；

所述msod2基因的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述msod2基因的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述msod2基因的探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选的，还包括2×pcr预混液。

本发明提供了所述的试剂盒在定量检测样品中木薯成分的应用。

优选的，所述定量检测木薯成分的方法，包括以下步骤：

1)提取系列梯度质量的木薯的基因组dna；

2)以步骤1)中木薯基因组dna为扩增模板，基于微滴式数字pcr扩增msod2基因；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字pcr反应扩增结果，得到msod2基因的拷贝浓度；

4)建立木薯质量与msod2基因的拷贝浓度的线性关系；

5)采用微滴式数字pcr反应扩增样品中msod2基因，读取和分析微滴式数字pcr反应扩增结果，得到样品的msod2基因的拷贝浓度；

6)将待测样品的msod2基因的拷贝浓度代入步骤4)中得到的线性关系中换算，得到样品中木薯成分的含量。

优选的，步骤2)中所述微滴式数字pcr的反应体系如下：2×pcr预混液10μl、10μmol/μl的上游引物0.5μl、10μmol/μl的下游引物浓度0.5μl、10μmol/μl探针0.5μl，扩增模板2μl，补水至20μl。

优选的，步骤2)中所述微滴式数字pcr的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。

优选的，步骤1)中木薯基因组dna的提取方法包括试剂盒法和ctab法。

优选的，步骤1)中木薯的系列梯度质量包括5mg、15mg、30mg、40mg和50mg。

优选的，步骤4)中木薯质量与msod2基因的拷贝浓度的线性关系为y＝16.695x-23.967，r²＝0.9859其中y表示msod2基因的拷贝浓度，单位为拷贝数/μl，x表示木薯的质量，单位为mg。

优选的，样品包括饲料或食品。

本发明提供的一种基于微滴数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒，是以木薯基因组单拷贝基因msod2基因为检测对象，设计特异的引物和探针，建立基于微滴式数字pcr定量方法扩增长度76bp的msod2基因，从而实现对木薯成分的特异性定量检测。实施例1的木薯成分的特异性实验表明，采用本发明提供的引物探针对红薯、耦、芋头、茄子、胡萝卜、蕃茄、芹菜、大米、大豆和大麦作物等样品进行检测，仅对木薯能获得典型扩增曲线，说明本发明的检测试剂盒具有良好的特异性。

本发明提供了所述的试剂盒在定量检测样品中木薯成分的应用。所述定量检测样品中木薯成分的应用是基于微滴式数字pcr定量方法，操作步骤简便，并且能够快速获得检测结果。loq为10个平行均可检出且其平行实验的拷贝数浓度的rsd小于25％，为1.31拷贝/μl，lod为10个平行不少于9个均能检测出来的最低拷贝数浓度0.25拷贝/μl。同时本发明提供的应用，对于质量百分比分别为5％和25％的样本，在ddpcr检测结果分别为5.77％和23.32％，回收率分别115.40％和93.26％，三个平行之间的rsd值在3.53％～4.19％之间。根据评价标准，本方法可对质量百分比为5％及以上的木薯成分进行准确定量，适用范围广且检测灵敏度较高。

附图说明

图1为本发明提供的试剂盒的特异性测试图；

图2为木薯质量与拷贝数浓度线性关系图；

图3为木薯dna浓度拷贝数测试热点图；

图4为木薯dna浓度梯度lod、loq测试热点图，其中图4-1为木薯dna浓度梯度lod测试热点图，图4-2为木薯dna浓度梯度loq测试热点图；

图5为木薯模拟样品测试结果热点图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于微滴式数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒，包括msod2基因的上游引物、msod2基因的下游引物和msod2基因的探针；

所述msod2基因的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述msod2基因的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述msod2基因的探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。

在本发明中，所述msod2基因的上游引物、下游引物和探针的来源没有特殊限制，委托本领域所熟知的基因合成公司即可。所述上游引物和下游引物扩增msod2基因的长度为76bp(tgcaagcaaagaacaaaatcgtaattaaacttctggctggtttgccccgtttgtttttgtgatggaaaatgttgtg，seqidno.4)。所述探针的5’端连接有一个荧光报告基团fam，所述探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括2×pcr预混液。本发明对所述2×pcr预混液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的适用于微滴式数字pcr的来源即可。在本发明实施例中，所述2×pcr预混液购自伯乐公司。

本发明提供了所述的试剂盒在定量检测样品中木薯成分的应用。

在本发明中，所述定量检测木薯成分的方法，优选包括以下步骤：

1)提取系列梯度质量的木薯的基因组dna；

2)以步骤1)中木薯基因组dna为扩增模板，基于微滴式数字pcr扩增msod2基因；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字pcr反应扩增结果，得到msod2基因的拷贝浓度；

4)建立木薯质量与msod2基因的拷贝浓度的线性关系；

5)采用微滴式数字pcr反应扩增样品中msod2基因，读取和分析微滴式数字pcr反应扩增结果，得到样品的msod2基因的拷贝浓度；

6)将待测样品的msod2基因的拷贝浓度代入步骤4)中得到的线性关系中换算，得到样品中木薯成分的含量。

在本发明中，木薯基因组dna的提取方法优选包括试剂盒法和ctab法。所述试剂盒法中所用的试剂盒优选为wizardgenomicdnapurificationkit(promega，a1120)。所述ctab法为本领域常规的ctab法即可。

在本发明中，木薯的系列梯度质量包括5mg、15mg、30mg、40mg和50mg。本发明对所述木薯的品种和来源没有特殊限制，本领域所熟知的木薯品种和常见来源均可适用本发明提供的应用。

在本发明中，以木薯基因组dna为扩增模板，基于微滴式数字pcr扩增msod2基因。

在本发明中，所述微滴式数字pcr的反应体系优选如下：2×pcr预混液10μl、10μmol/μl的上游引物0.5μl、10μmol/μl的下游引物浓度0.5μl、10μmol/μl探针0.5μl，扩增模板2μl，补水至20μl。配制得到20μl的反应体系后，将20μl的反应体系和70μl微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴全部转移至96孔板中，封膜后置于热循环仪中进行pcr反应。所述微滴式数字pcr的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。微滴式数字pcr扩增是通过将常规的pcr反应体系分隔成大量微滴扩增体系。将分隔后的pcr反应体系进行扩增后，逐一检查每一个小的反应体系中是否产生阳性荧光信号。通过泊松分布计算得到的微反应中的拷贝数。所述微滴数字pcr数据读取方法优选具有如下：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用quantasoftv1.3.2软件分析实验数据。

在本发明中，木薯质量与msod2基因的拷贝浓度的线性关系为y＝16.695x-23.967，r²＝0.9859，其中y表示msod2基因的拷贝浓度，单位为拷贝数/μl，x表示木薯的质量，单位为mg。

在本发明中，样品包括含有木薯成分的物质，优选包括饲料或食品。

在本发明中，所述定量检测木薯成分过程中质量控制包括有效微反应数的控制和空白对照的质量控制。有效微反应数的控制是在数字pcr体系分割过程中产生的有效微反应的总数量不得低于平台理论数的60％(即12000个)；所述空白对照的质量控制是数字pcr空白对照理论检测结果应为零。但在实际检测中，允许有极少量阳性体系数出现。空白对照中阳性微反应体系数应小于实际有效体系数的0.03％。以上质控条件中有一项不符合者，实验结果应放弃，并重新进行数字pcr实验。所述定量检测木薯成分过程中性能指标是指对梯度浓度的dna样品进行数字pcr定量检测其拷贝数浓度，每个浓度设置10个平行，计算各浓度平行检测结果的rsd值。以rsd≤25％作为有效定量数据的判断依据，定量检测限loq为检测结果的rsd≤25％时最低拷贝数浓度。lod以10个平行中不少于9个能检出的最低拷贝数浓度。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于微滴式数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

木薯成分的特异性验证

分别提取木薯、木薯、红薯、耦、芋头、茄子、胡萝卜、蕃茄、芹菜、大米、大豆和大麦作物的基因组dna，以提取的基因组dna为模板，用msod2基因的上游引物(tgcaagcaaagaacaaaatcgt，seqidno.1)、msod2基因的下游引物(cacaacattttccatcacaaaaaca，seqidno.2)和msod2基因的探针(attaaacttctggctggtttgccccgt，seqidno.3)进行荧光定量pcr扩增，qpcr的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。扩增曲线见图1，其中只有木薯有典型的s型扩增曲线，其他作物均无典型扩增曲线。表明本发明设计的引物探针特异于木薯的检测，物异性良好。

实施例2

木薯质量(mg)与拷贝数浓度(copies/μl)的线性关系

称取梯度质量木薯粉样品5mg，15mg，30mg，40mg，50mg，采用wizardgenomicdnapurificationkit(promega，a1120)提取基因组dna，采用20μl数字pcr反应体系(2×ddpcrtm预混液10μl；浓度为10μmol/μl的引物各0.5μl，浓度为10μmol/μl的探针0.5μl，dna模板2μl，补水至20μl。ddpcr反应条件为：95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s(1℃/s)，60℃，1min(1℃/s)，共40个循环；98℃，10min(1℃/s)，12℃保存反应产物。扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用quantasoftv1.3.2软件分析实验数据。

获得的数据如表1，建立木薯质量(mg)与拷贝数浓度(copies/μl)线性关系数据如图2。

表1木薯质量与拷贝数浓度线性关系的实验结果

实施例3

木薯dna浓度检测的最低检测限(lod)和定量限(loq)测定

木薯特异基因数字pcr检测的拷贝数浓度与dna浓度的线性关系：采用dna浓度梯度为18ng/μl、3.6ng/μl、1.8ng/μl、0.6ng/μl和0.2ng/μl，每个梯度三个平行。判定条件为：loq以检测结果的相对标准偏差(rsd)小于25％所对应的最低拷贝数浓度，lod以10个平行中不少于9个能检出的最低拷贝数浓度。木薯dna浓度拷贝数测试结果的数据如表2。木薯dna浓度拷贝数测试热点图见图3。木薯dna浓度梯度lod、loq测试热点图见图4。

表2木薯dna浓度拷贝数测试结果

表3木薯dna浓度梯度lod、loq测试结果

由表3可知loq为10个平行均可检出且其平行实验的拷贝数浓度的rsd小于25％，为1.31拷贝/μl。

由表3可知lod为10个平行均能检测出来的最低浓度为0.25拷贝/μl。

实施例3

模拟样品检测

供试样本：以大豆粉为基质，在其中掺入质量百分比为1％、5％和25％木薯粉，用试管研磨机进行混匀，制备混合样各10g。每个样品称取3个平行，每个平行50mg，分别进行基因组dna提取，每个称样平行分别进行1个平行的ddpcr。木薯模拟样品测试结果热点图见图5。以回收率和rsd评价本方法的准确度和精密度，以回收率在80～120％和rsd≤25％作为质量百分比定量数据的评价标准。

由图5可知，b04、c04、d04为木薯质量百分比1％的样本，e04、f04、g04为质量百分比5％的样本，h04、a05、b05为质量百分比25％的样本，木薯模拟样品测试结果的数据如表4。

表4木薯模拟样品测试结果

经过线性关系换算结果可知，对于质量百分比分别5％和25％样本，在ddpcr检测结果分别为5.77％和23.32％，回收率分别115.40％和93.26％，三个平行之间的rsd值在3.53％～4.19％之间。根据评价标准，本发明提供的检测试剂盒可对质量百分比为5％及以上的木薯成分进行准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种基于微滴式数字pcr定量检测木薯成分的试剂盒及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgcaagcaaagaacaaaatcgt22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacaacattttccatcacaaaaaca25

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

attaaacttctggctggtttgccccgt27

<210>4

<211>76

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgcaagcaaagaacaaaatcgtaattaaacttctggctggtttgccccgtttgtttttgt60

gatggaaaatgttgtg76