银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种内生真菌代谢产物及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

(二)

背景技术：

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，包括内生真菌和内生细菌。近年来，国内陆续报道了从多种药用植物中已分离获得了产生多种药理活性物质的内生菌。银杏作为一种古老的药用植物，素有“活化石”之称，其具有抗肿瘤、抑菌等多种药理活性。目前，银杏等其他物种资源都非常匮乏，如果大量地采伐又涉及到生态和环境等领域的问题。因此，寻找一种可以高效低耗地开发利用天然药物的方法日益重要药用植物内生菌也因此成为研究热点。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种银杏内生真菌代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)gb.py-f1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液经微孔滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇gb.py-f1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm2019125，保藏日期为2019年3月6日，地址为中国武汉武汉大学，邮编430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为样品gf.11；(3)将步骤(2)样品gf.11用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比60:1→0:1的氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱，收集体积比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分gf.11-8；(4)组分gf.11-8以体积比1:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行凝胶sephadexlh-20柱分离，收集第1至第4个柱体积的流出液，浓缩至0.05倍体积，获得浓缩液；(5)将步骤(4)浓缩液用半制备液相分离，以体积比80:20的乙腈：水为流动相，流速为3ml/min，收集第3-4分钟所出的单峰，浓缩至干燥，得银杏内生真菌代谢产物。

进一步，步骤(1)发酵液制备方法为：将黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)gb.py-f1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2。

进一步，步骤(1)代谢粗产物制备方法为：在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理后抽滤，取滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇gb.py-f1代谢粗产物。

进一步，步骤(2)按如下操作进行：将步骤(1)黄盖小脆柄菇gb.py-f1代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，采用体积比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为样品gf.11；所述硅胶与代谢粗产物质量比为1.5：1。

进一步，步骤(2)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱体积比依次为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100。

进一步，步骤(3)按如下操作进行将步骤(2)样品gf.11用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品gf.11的硅胶，将吸附样品gf.11的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比60:1→0:1的氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱，收集体积比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分gf.11-8；所述硅胶与样品gf.11质量比为1.5：1。

进一步，步骤(5)按如下操作进行：将步骤(4)浓缩液用半制备液相分离，采用ods柱，以体积比80:20的乙腈：水为流动相，流速为3ml/min，柱温25℃，进样量每次为0.5ml，收集第3-4分钟所出的单峰，浓缩至干燥，得银杏内生真菌代谢产物。

更进一步，本发明所述银杏内生真菌代谢产物按如下方法制备：

(1)将黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)gb.py-f1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯萃取(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇gb.py-f1代谢粗产物；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟；

(2)将步骤(1)代谢粗产物用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶，所述硅胶与代谢粗产物质量比为1.5：1；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(优选6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用体积比100-0:0-100(优选100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为样品gf.11；(3)将样品gf.11用微量乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品gf.11的硅胶，所述硅胶与样品gf.11质量比为1.5：1，将吸附样品gf.11的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比60:1→0:1(60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:1)的氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱，收集体积比5:1的流出液，浓缩至干，记为组分gf.11-8；(4)组分gf.11-8用凝胶sephadexlh-20以体积比1:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行柱分离，收集第1到第4个柱体积的流出液，浓缩至0.05倍体积，获得浓缩液；(5)步骤(4)浓缩液进行半制备液相分离，采用ods柱(型号以及参数：luna，5μm，c18(2)，100a，250×10mm)，以乙腈：水＝80:20，v/v为流动相，流速为3ml/min，柱温25℃，进样量每次为0.5ml，接第3-4分钟所出的单峰，合并所有3-4分钟所收集得到的组分，浓缩至干燥，得银杏内生菌代谢产物，记为产物gf.11-8-3。

本发明所述黄盖小脆柄菇gb.py-f1，菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色。

本发明还提供一种所述银杏内生真菌代谢产物在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(cmcc(b)26003)抑菌剂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用，所述银杏内生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌mic＝6.25mg/ml。天然成分的抑菌剂，安全性高。

(四)附图说明

图1为菌株gb.py-f1系统发育树。

图2为菌株gb.py-f1代谢产物对金黄色球菌的抑菌能力，1：1.56mg/ml；2：0.78mg/ml；3：0.39mg/ml。

图3为银杏内生真菌代谢产物的¹h-nmr图谱。

图4为银杏内生真菌代谢产物的¹³c-nmr图谱。

图5为银杏内生真菌代谢产物的ms图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：ginkgobilobal.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。

本发明所述超纯水是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：黄盖小脆柄菇gb.py-f1的分离

1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡15分钟，然后用无菌水漂洗三次，收集漂洗液。用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分至干燥，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，放置pda培养基的无菌平板作为空白对照1，用于检查超净工作台的洁净程度；将最终的漂洗液接种于pda培养基的无菌平板作为空白对照2，用于漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于pda培养基的无菌平板中滚一圈后取出，作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块。

2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在pda培养基中，在30℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于pda培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌pda培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种内生真菌生长时说明纯化完成，得到1号菌落呈白色放射状，干燥，产大量肉眼可见黄色色素，菌落老化后成浅黄棕色，无肉眼可见孢子，菌落背面为深黄色；2号菌株为白色疏松绒毛状，有大量黄绿色孢子，菌落背面成点状，代谢物无明显颜色；3号菌株为灰粉色絮状，水波纹放射状，菌落背面为黑色；1号菌株记为菌株gb.py-f1。pda培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，自然ph。

3.总dna的提取：将菌株gb.py-f1接种于pda培养基中，于30℃恒温培养箱中倒置培养5d，采用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：b518229)以及相关操作说明提取基因组dna：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5ml离心管中，依次加入400μlbufferdigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μlbufferpf，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的dna用50-100μltebuffer溶解。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。

4.菌株gb.py-f1的its序列扩增：采用真菌扩增通用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增内部转录区间序列，反应体系如下：

dna模板1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、pcrmix12.5μl、ddh2o9.5μl。

pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.pcr反应产物确认：取5μlpcr产物与1μldangreen染料混合后点样于1.2％琼脂糖凝胶，110v条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带，如出现500bp左右条带，则初步判断扩增成功。

6.pcr反应产物测序：将pcr产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株gb.py-f1的its序列见seqidno.1所示。

7.数据分析：用blast比对将菌株gb.py-f1的序列与genbank中的序列进行同源性比对，blast检索表明，菌株gb.py-f1的its序列与psathyrellacandolleana(黄盖小脆柄菇)(genbank登录号ab470877.1)的序列相似度为99％，绘制系统发育树见图1所示。由图1可知支持率为97％，根据基因亲缘性对比确定菌株gb.py-f1为小脆柄菇(psathyrella)属，命名为黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm2019125，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072。

实施例2：银杏果内生菌代谢产物的分离

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的黄盖小脆柄菇gb.py-f1接种于pda培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、银杏果内生菌代谢产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的gb.py-f1菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，28℃，180r/min培养7d，以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液，采用y92-iidn型超声波细胞粉碎机在405w条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理，然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，微滤液利用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3，用1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪浓缩干燥至恒重，获得银杏果内生菌代谢粗产物(简称：gb-1ea)32.264g，于-20℃保存。

所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，蔗糖30g/l，溶剂为蒸馏水，ph7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。

3、分离纯化代谢粗产物：(1)称取10克gb-1ea，用5-10ml乙酸乙酯溶解，加入15克硅胶(200～300目)，研磨均匀后，置于减压真空干燥器中干燥，即为吸附样品的硅胶。将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱(6cm*60cm)中，装柱量3/4，采用石油醚-乙酸乙酯(100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v)梯度洗脱，分别11个流出液，将体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液浓缩至干，得组分gf.11；(2)将10g组分gf.11用微量乙酸乙酯溶解，加入15g硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附组分gf.11的硅胶，将吸附组分gf.11的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，以体积比60:1→0:1(60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:1)的氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱，收集体积比5:1的流出液，浓缩至干，记为组分gf.11-8；(3)组分gf.11-8用凝胶sephadexlh-20以体积比1:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行柱分离，收集第1至第4个柱体积的流出液并浓缩至0.05倍体积，获得浓缩液；(4)步骤(3)浓缩液进行半制备液相分离，采用ods柱(型号以及参数：luna,5μm,c18(2),100a,250×10mm)，以乙腈：水＝80:20，v/v为流动相，流速为3ml/min，柱温25℃，进样量每次为0.5ml，接第3到第4分钟所出的单峰，合并所有3-4分钟所收集得到的组分，浓缩至干，得68.3mg银杏内生菌代谢产物，记为组分gf.11-8-3，溶于氘代氯仿中，进行核磁波普以及质谱分析，结果见于图3-5，组分gf.11-8-3含有水溶性维生素、酰胺化合物。

实施例3：银杏内生菌代谢产物对金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)抑制能力的测定

银杏内生菌代谢产物对金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)的最低抑制浓度测定：称取实施例2获得的25mg银杏内生菌代谢产物，溶于1mldmso中，配置25mg/ml的样品储备液。在超净工作台中，储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，取200μl过滤后的样品于96孔板f和g中，用无菌lb液体培养基依次半倍稀释为不同浓度(0，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.7812，0.3906，0.1953，0.0976，0.0488mg/ml)，即f2与g2：0，f2与g2：25mg/ml，f3与g3：12.5mg/ml，f4与g4：6.25mg/ml，f5与g5：3.125，f6与g6：1.5625mg/ml，f7与g7：0.7812mg/ml，f8与g8：0.3906mg/ml，f9与g9：0.1953mg/ml，f10与g10：0.0976mg/ml，f11与g11：0.0488mg/ml。

将金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)，在超净工作台中接种于含lb固体培养基的无菌平板中进行活化(37℃，24h)，将活化后的金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003，取一环接种于含有lb液体培养基(50ml)的无菌锥形瓶(250ml)中进行培养(37℃，180r/min，24h)，用无菌水将菌液进行稀释使得菌悬液浓度为10⁶cfu/ml备用，将10μl该菌液接种于f2至f11培养孔，将10μl无菌lb液体培养基接种于g2至g11培养孔中作为对照组，将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养1d，肉眼观察孔中培养基是否浑浊，是否有菌体沉淀于孔底部，结果见于图2；mic＝6.25mg/ml。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>679

<212>dna

<213>黄盖小脆柄菇(psathyrellacandolleana)

<400>1

tgatatgcttaagttcagcgggtagtcctacctgatttgaggtcaaattggtcaagtaaa60

ttgtccttgcggacggttagaagcaagcatgagtccaatccacggcgtagataattatca120

caccaatagacggaagctcaatatgagctcgctaatgcatttcaggagagcagaccagca180

ctgaggcagcctgcaaaacccccacatccaagcctacacctgtctcgttacaaaactggt240

gaggttgagaatttaatgacactcaaacaggcatgctcctcggaataccaaggagcgcaa300

ggtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcattt360

cgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgctgaaagttgtatagtttt420

ttataggcatgaaagcccattgactacattctaaatcattcaaatggggtgtgtaaaaga480

catagaacctggaaattcaaagagagccggcctagtcggcgcagcaatccttgcatccgc540

tttgctgccaaagcgaggggtatccaggcctacacatggttcacaggtggaaagatgata600

tgaatgacgggcgtgcacaatgctcctaggagccagctacaaccaacgccatagatattc660

gataatgatccttccgcag679