鉴别猪圆环病毒3型两个基因亚型的实时荧光定量PCR-HRM引物的制作方法

本发明涉及一组用于检测猪圆环病毒3型（porcinecircovirustype3，pcv3）两个基因亚型（g1基因型和g2基因型，pcv3-g1和pcv3-g2）的pcr-hrm引物，属于动物传染病学领域。

背景技术：

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（pdns）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（porcinecircovirus3，pcv3）。流行病学调查发现pcv3感染多见于具有pdns和繁殖障碍症状猪群，目前已于美国多个州猪群内普遍流行。随后，我国多个省市猪群中也检测出pcv3。近来，波兰和韩国相继报道存在pcv3感染猪群。作为一种新发现病原体，pcv3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（pcvad）中作用以及现有商品化pcv2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。

和pcv1、pcv2一样，pcv3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股dna病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。对pcv2的研究发现，pcv2存在多个基因亚型（pcv2a、pcv2b、pcv2c、pcv2d、pcv2e等），不同的基因亚型pcv2存在致病力差异。基于对pcv3的cap蛋白的遗传进化分析可见，pcv3可以划分为两个明显的基因亚型（pcv3-g1和pcv3-g2）（xupl,zhangy,zhaoy,zhenghh,hanhy,zhanghx,chenhy,yangmf,zhengll.detectionandphylogeneticanalysisofporcinecircovirustype3incentralchina.transboundemergdis.2018oct;65(5):1163-1169.doi:10.1111/tbed.12920.），关于pcv3-g1和pcv3-g2两种基因型的鉴别诊断方法，目前尚未见相关研究报道。

高分辨率熔解曲线（highresolutionmelt，hrm）是一种简单、快速、低成本的pcr扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准pcr试剂的基础上再加入双链dna结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。当使用sybrgreeni为荧光染料时，在实时荧光pcr扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将pcr产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链dna解链成单链dna分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与dna脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链。本发明通过将pcv3-g1和pcv3-g2的cap蛋白编码区核苷酸序列进行分析比较发现，pcv3-g1和pcv3-g2的cap蛋白编码区核苷酸序列存在特征性差异，本发明创造点的基于pcv3-g1和pcv3-g2的cap蛋白编码区核苷酸序列特征差异来设计引物，仅仅需要一组（两条）引物，建立特异性的实时荧光定量pcr-hrm方法，即可特异性的对pcv3-g1和pcv3-g2进行鉴别诊断，为后续开展pcv3-g1和pcv3-g2不同基因型致病力差异研究提供手段。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供鉴别猪圆环病毒3型两个基因亚型的实时荧光定量pcr-hrm引物，为后续开展pcv3-g1和pcv3-g2不同基因型致病力差异研究提供手段。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

用于检测猪圆环病毒3型两个基因亚型的实时荧光定量pcr-hrm引物，所述引物组其核苷酸序列如下所示：

上游引物p1：5’-accccgcccaaggagacgacga-3’

下游引物p2：5’-ggaaatgacgttcatggtggagt-3’。

用于检测猪圆环病毒3型两个基因亚型的实时荧光定量pcr-hrm方法，包含以下步骤：

（1）、从疑似临床样品中提取基因组dna；

（2）、以提取的dna为模板，用所述的引物p1和p2进行实时荧光定量pcr扩增；

（3）、利用高分辨率熔解曲线方法导致的猪圆环病毒3型两个基因亚型熔解温度（tm）值差异，对两个基因亚型进行鉴别。

所述的pcr-hrm引物在制备鉴别诊断猪圆环病毒3型两个基因亚型试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明所提供的引物特异性强，灵敏度高，鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量pcr引物对本临床送检54份疑似猪pmws病料进行检测，实时荧光定量pcr方法检测到pcv3-g1阳性4份，tm值分别为84.9℃、84.8℃、84.9℃、84.9℃，阳性率为7.41%。实时荧光定量pcr方法检测到pcv3-g2阳性7份，tm值分别为85.8℃、85.9℃、85.9℃、85.9℃、85.8℃、85.8℃、85.8℃，阳性率为12.96%，表明本发明建立的方法，可用于临床开展pcv3-g1和pcv3-g2鉴别诊断研究。

附图说明

图1pcv3基因遗传进化分析和亚型划分。

图2pcv3两个基因型核苷酸同源性比较。

图3pcv3-g1和pcv3-g2核苷酸差异区分析。

图4实时荧光定量pcr方法的引物设计区域。

图5熔解曲线分析。

图6扩增曲线分析。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（pcv1）和猪圆环病毒2型（pcv2）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

pcv3-g1和pcv3-g2单一阳性基因组dna由建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2、pcv3基因分型研究

从文献（xupl,zhangy,zhaoy,zhenghh,hanhy,zhanghx,chenhy,yangmf,zhengll.detectionandphylogeneticanalysisofporcinecircovirustype3incentralchina.transboundemergdis.2018oct;65(5):1163-1169.doi:10.1111/tbed.12920.）可见，pcv3可以基于cap基因分为两个基因型（g1基因型和g2基因型）（图1），且2个基因型均可进一步细分为更细的基因亚型。

3、引物设计与合成

3.1pcv3-g1和pcv3-g2序列比对

以pcv3-g1代表株（genbank登陆号ky075989、ky075990、ky075991）和pcv3-g2代表株（genbank登陆号ky075992、ky075986、kx898030）为例，选择dnastar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见：pcv3-g1相互之间的核苷酸同源性在99.8%以上，pcv3-g2相互之间的核苷酸同源性在98.8%以上，pcv3-g1和pcv3-g2相互之间的核苷酸同源性在98.3%-98.4%之间（图2）。

经核苷酸同源性比对发现（图3），pcv3-g1和pcv3-g2在rep的5’-端区域存在特征性核苷酸差异（pcv3-g1第60位、71位和80位核苷酸序列位g、t和a；而pcv3-g2第60位、71位和80位核苷酸序列位a、c和g），且在特征的核苷酸差异区的前后pcv3-g1和pcv3-g2核苷酸序列均一致。

3.2引物设计

基于3.1的分析结果，在pcv3-g1和pcv3-g2特异性的保守区——前端保守区设计特异性的上游引物p1（图4），在保守区——后端保守区设计特异性的下游引物p2（图4），该引物就可以同时对pcv1和pcv2进行扩增，

其中引物p1和p2序列为：

上游引物p1：5’-accccgcccaaggagacgacga-3’

下游引物p2：5’-ggaaatgacgttcatggtggagt-3’。

该引物的对pcv3-g1和pcv3-g2的扩增区域长均为121bp。

4、实时荧光定量pcr扩增

以常规方法提取pcv3-g1和pcv3-g2的基因组dna。用所设计的特异性实时荧光定量pcr引物p1和p2进行实时荧光定量pcr扩增。

优化出的20μl最佳反应体系为体系：sybrpremixextaqtm10μl、上/下游引物（10μmol/l）各0.2μl、模板1μl、水补足至终体积20μl。最佳反应条件为：95℃1min预变性；95℃10s、60℃20s，共40个循环，循环结束后，做出熔解曲线。

5、实时荧光定量pcr熔解曲线

实时荧光定量pcr反应结束后，根据做出的熔解曲线，根据pcv3-g1和pcv3-g2存在特异性核苷酸缺失导致扩增区域的gc含量差异，gc含量差异会导致出现特异性的熔解曲线峰值tm值存在差异对pcv3-g1和pcv3-g2感染进行判断，结果为：

从生成的熔解曲线（图5）可见看出，若在tm=（84.88±0.08）℃出现单一的特异性峰判为pcv3-g1阳性；若在tm=（85.80±0.07）℃出现单一的特异性峰判为pcv3-g2阳性。

、特异性实验

以优化后条件和温度对猪群常见传染病，如猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）、猪细环病毒（pttv）进行扩增，扩增后观察熔解曲线和扩增曲线，判断本研究的特异性。

从熔解曲线（图5）分析可见，仅pcv3-g1和pcv3-g2可出现特异性的熔解曲线峰值，而其他猪群常见传染病（pcv1、pcv2、ppv、prv、v-prv、prrsv、pedv和pttv）均未见特异性的熔解曲线峰值（见图5的实验对照）。

从扩增曲线（图6）分析可见，仅pcv3-g1和pcv3-g2可出现特异性的扩增曲线，而其他猪群常见传染病（pcv1、pcv2、ppv、prv、v-prv、prrsv、pedv和pttv）均未见特异性的扩增曲线（见图6的实验对照）。

从熔解曲线和扩增曲线可见，本发明的引物特异性强。

7、临床应用

应用本方法对临床送检54份猪pmws病料进行检测，将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组dna，利用优化后的方法进行实时荧光定量pcr检测。结果可见，实时荧光定量pcr方法检测到pcv3-g1阳性4份，tm值分别为84.9℃、84.8℃、84.9℃、84.9℃，阳性率为7.41%。实时荧光定量pcr方法检测到pcv3-g2阳性7份，tm值分别为85.8℃、85.9℃、85.9℃、85.9℃、85.8℃、85.8℃、85.8℃，阳性率为12.96%，表明本发明建立的方法，可用于临床开展pcv3-g1和pcv3-g2鉴别诊断研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农科院畜牧兽医研究所

<120>鉴别猪圆环病毒3型两个基因亚型的实时荧光定量pcr-hrm引物

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