一种可溶性重组NGAL蛋白氨基酸、基因序列及蛋白制备方法与流程

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种可溶性重组ngal蛋白氨基酸、基因序列及蛋白制备方法。

背景技术：

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)由于分子量小，对蛋白酶有天然的抗性，在肾脏损伤后很快聚积，在尿液中出现早，可作为急性肾衰的诊断标记物，是有效评价急性肾衰临床治疗效果及预后的良好指标。

同时，ngal在肿瘤中的作用日益受到关注，在乳腺癌，肺癌，胰腺癌以及大肠癌等多种肿瘤中均发现ngal过表达，这提示ngal极有可能是一种新的肿瘤相关基因，其蛋白产物可能是一个新的肿瘤标志物。由此可见获得具有天然构象和生物活性的ngal蛋白是有重要意义的。

大肠杆菌是常用的可快速高效生产外源重组蛋白的宿主，但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。为了限制包涵体的产生和促进蛋白质能够以天然三维构象折叠，通常采用融合伴侣(fusionpartner)表达策略，如选择麦芽糖结合蛋白(mbp)作为ngal的融合标签蛋白，以提高ngal在大肠杆菌中的可溶性表达能力，但是mbp-ngal包含靶蛋白在内的融合蛋白低效裂解，存在纯化上的困难，一定程度上影响了目的蛋白的表达纯化；dsba是近年来发现的能够帮助肤链内二硫键形成的另一种重要的分子内伴侣，dsb2a.0-ngal融合蛋白进行亲和层析、thrombin酶切与分子筛过滤纯化，导致纯化步骤复杂化，最终纯的靶蛋白得率较低。his-ngal融合蛋白的纯化得率高，但可溶性差，包涵体上柱前需先经过复杂的提取过程，耗时长、人工大，而且加入较多的还原剂等对人源天然蛋白的空间结构不可逆的的影响，限制了ngal的临床应用及推广。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供一种可溶性重组ngal蛋白氨基酸、基因序列及蛋白制备方法，能够采用大肠杆菌表达系统表达获得可溶性蛋白；通过优化ngal的编码基因，建立了ngal蛋白的原核可溶性表达制备体系，并且提供了一种可溶性重组ngal蛋白的纯化方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的氨基酸，所述氨基酸序列如seqidno:2所示。

一种编码所述可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白氨基酸的基因序列，所述基因序列如seqidno:1所示。

一种可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的制备方法，包括如下步骤：

人工合成重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白基因序列：以大肠杆菌为宿主菌的偏好性进行序列优化，在核酸5’端、3’端分别添加bamh1、ecor1限制性核酸酶切位点，合成的所述基因序列如seqidno:1所示；

构建包含所述基因序列的原核表达载体；

在宿主细胞中表达包含所述基因序列的表达载体，通过纯化获得可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。

进一步地，所述纯化的方法包括：

(1)将用于表达所述可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的宿主细胞进行破碎，离心分离收集上清液；

(2)采用ni柱亲和层析纯化，具体为：

用柱平衡液平衡ni柱，并调至基线数值为0，所述柱平衡液为15mmol/l的pb磷酸盐缓冲液；

将步骤(1)中收集的上清经过滤膜过滤，过滤后上清直接上柱，于4-12℃结合完全；上样过程中允许的上样量即v菌液量：v柱范围为(20-100)：1，上样缓冲液为20mmol/l的pb磷酸盐缓冲液；

待上样完毕进行杂蛋白洗脱，用pbs洗涤结合后柱子，至od280吸收值至基线；

然后使用elusionbufer洗脱，收集洗脱峰，获得可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。

进一步地，步骤(1)具体为：采用超声破碎宿主细胞，超声破碎条件为30s开，30s关，时长30min；超声缓冲液为15mmol/l磷酸盐缓冲液；然后离心分离收集上清液，离心速度为10000rpm，20min。

进一步地，进行杂蛋白洗脱的洗脱液为：30mmol/l咪唑、20mmol/lpb缓冲液；

所述elusionbufer包括20mmpb，300mm咪唑；ph为7.4。

进一步地，所述原核表达载体采用pet-28a(+)或pet-30a(+)载体；

所述宿主细胞采用bl21。

进一步地，采用iptg诱导表达，iptg终浓度为0.4mmol/l，诱导表达培养温度为25℃，诱导表达时间为12-16h。

本发明的有益技术效果：

本发明提供的可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的基因序列是将表达人源的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸序列进行抗原表位分析选取合适序列后，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后获得。

本发明提供了一种可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的制备方法，能够采用大肠杆菌表达系统表达获得可溶性蛋白；通过优化ngal的编码基因，建立了ngal蛋白的原核可溶性表达制备体系，制备获得的ngal蛋白完全可溶，并且提供了一种可溶性重组ngal蛋白的纯化方法。能够解决ngal的可溶性表达的问题，可以使人ngal蛋白的产量提高2-3倍，并且方法简单，成本低。本发明所述方法采用ni亲和层析柱进行蛋白纯化，由于可溶性重组蛋白大量表达的优点，不仅纯化操作过程便捷、纯度高，而且生产成本低廉，更加适用于上述蛋白的规模化工业化生产，为ngal检测试剂盒的研发提供优质原料。

附图说明

图1为包含pet-28a(+)为载体于宿主细胞表达的重组ngal蛋白sds-page结果图；

图2为包含pet-30a(+)为载体于宿主细胞表达的重组ngal蛋白sds-page结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

针对现有技术中，以大肠杆菌为宿主细胞表达ngal蛋白存在产物纯化困难、表达产物的生物活性较低、产生包涵体，以及采用融合伴侣(fusionpartner)表达存在纯化困难、纯化步骤复杂、纯的靶蛋白得率低、可溶性差，从而限制了ngal的临床应用及推广的技术问题。

本发明实施例提供一种可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的氨基酸，所述氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明实施例提供一种编码所述可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白氨基酸的基因序列，所述基因序列如seqidno:1所示。

本发明实施例提供一种可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的制备方法，包括如下步骤：

人工合成重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白基因序列：以大肠杆菌为宿主菌的偏好性进行序列优化，在核酸5’端、3’端分别添加bamh1、ecor1限制性核酸酶切位点，合成的所述基因序列如seqidno:1所示；

构建包含所述基因序列的原核表达载体，优选地，在本实施例中，所述原核表达载体是pet-28a(+)、pet-30a(+)载体；

在宿主细胞中表达包含所述基因序列的表达载体，通过纯化获得可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。优选的，所述宿主细胞是bl21；采用iptg诱导表达，iptg终浓度为0.4mmol/l，诱导表达培养温度为25℃，诱导表达时间为12h。

所述纯化的方法包括：

(1)将用于表达所述可溶性重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的宿主细胞进行破碎，离心分离收集上清液；优选地，具体为采用超声破碎宿主细胞，超声破碎条件为30s开，30s关，时长30min；超声缓冲液为15mmol/l磷酸盐缓冲液；然后离心分离收集上清液，离心速度为10000rpm，20min。

(2)采用ni柱亲和层析纯化，具体为：

用柱平衡液平衡ni柱，并调至基线数值为0，所述柱平衡液为15mmol/l的pb磷酸盐缓冲液；

将步骤(1)中收集的上清经过0.45um滤膜过滤，过滤上清直接上柱，4-10℃结合1h；上样过程中上样量控制为菌液：柱体积比1000:10，上样缓冲液为20mmol/l的pb磷酸盐缓冲液；

待上样完毕进行杂蛋白洗脱，用pbs洗涤结合后柱子，至od280吸收值至基线；其中，洗脱溶液为30mmol/l咪唑、20mmol/lpb缓冲液；用20mmpbs洗涤结合后柱子，至od280吸收值至基线；

然后使用elusionbufer(20mmpb，300mm咪唑，ph7.4)洗脱，收集洗脱峰，sds-page分析纯度；

所述的sds-page结果图见图1和图2。图1为pet-28a(+)为载体于宿主细胞表达的重组ngal蛋白sds-page结果图；由左向右依次是marker、步骤(1)所得蛋白上清液、上样过程中的穿透液、步骤(2)30mmol/l咪唑洗脱收集峰、步骤(2)300mmol/l咪唑收集峰。图2为pet-30a(+)为载体于宿主细胞表达的重组ngal蛋白sds-page结果图；由左向右依次是marker、步骤(1)所得蛋白上清液、上样过程中的穿透液、步骤(2)30mmol/l咪唑收集峰、步骤(2)150mmol/l咪唑洗脱收集峰、300mmol/l咪唑洗脱收集峰。

(3)收集完成以后，使用10毫升1％醋酸对ni柱进行冲洗处理，再使用磷酸盐缓冲液均衡ph，大量无菌水对ni柱进行清洗，最后加入5ml20％乙醇，将清洗后ni柱保存于4℃，勿放在-20℃冷冻。

序列表

<110>青岛中科爱博生物科技有限公司

<120>一种可溶性重组ngal蛋白氨基酸、基因序列及蛋白制备方法

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<213>人工序列(artificialsequence)

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